Summary
Sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR)-basert påvisning og kvantifisering av hepatitt B-virus (HBV) DNA er en sensitiv og nøyaktig metode for diagnostisering og overvåking av HBV-infeksjon. Her presenterer vi en protokoll for HBV DNA-deteksjon og virusbelastningsmåling av en prøve.
Abstract
Hepatitt B-virus (HBV) er en betydelig årsak til leversykdom over hele verden. Det kan føre til akutte eller kroniske infeksjoner, noe som gjør individer svært utsatt for dødelig skrumplever og leverkreft. Nøyaktig påvisning og kvantifisering av HBV DNA i blodet er avgjørende for diagnostisering og overvåking av HBV-infeksjon. Den vanligste metoden for å oppdage HBV DNA er sanntids PCR, som kan brukes til å oppdage viruset og vurdere virusbelastningen for å overvåke responsen på antiviral terapi. Her beskriver vi en detaljert protokoll for påvisning og kvantifisering av HBV DNA i humant serum eller plasma ved bruk av et IVD-merket sanntids PCR-basert sett. Settet bruker primere og prober som retter seg mot den svært konserverte kjerneregionen i HBV-genomet og kan nøyaktig kvantifisere alle HBV-genotyper (A, B, C, D, E, F, G, H, I og J). Settet inneholder også en endogen internkontroll for å overvåke mulig PCR-hemming. Denne analysen går i 40 sykluser, og avskjæringen er 38 Ct. For kvantifisering av HBV DNA i kliniske prøver, følger et sett med 5 kvantifiseringsstandarder med settet. Standardene inneholder kjente konsentrasjoner av HBV-spesifikt DNA som er kalibrert mot 4. WHOs internasjonale standard for HBV DNA for nukleinsyretesten (NIBSC-kode 10/266). Standardene brukes til å validere funksjonaliteten til den HBV-spesifikke DNA-amplifiseringen og for å generere en standardkurve som tillater kvantifisering av HBV-DNA i en prøve. HBV DNA så lavt som 2,5 IE / ml ble detektert ved hjelp av PCR-settet. Den høye følsomheten og reproduserbarheten til settet gjør det til et kraftig verktøy i kliniske laboratorier, og hjelper helsepersonell med å effektivt diagnostisere og håndtere HBV-infeksjoner.
Introduction
Hepatitt B-virus (HBV) er et delvis dobbeltstrenget DNA-virus fra slektene Orthohepadnavirus og Hepadnaviridae-familien 1. Det kan utløse en kronisk infeksjon som vedvarer gjennom hele livet, som potensielt fører til levercirrhose og hepatocellulært karsinom 2,3,4. Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) levde en estimert befolkning på 296 millioner mennesker med kronisk hepatitt B-infeksjon i 2019, og 1,5 millioner mennesker ble nylig smittet hvert år5.
Identifisering og måling av HBV DNA i serum- eller plasmaprøver tjener som en verdifull metode for å oppdage personer med en pågående hepatitt B-infeksjon, vurdere effekten av antiviral behandling og forutsi sannsynligheten for behandlingssuksess 6,7,8,9,10,11. Høy viral belastning er forbundet med økt risiko for progresjon av leversykdom, inkludert skrumplever og leverkreft 12,13. Derfor er presis måling av virusbelastning avgjørende for å spore utviklingen av HBV-infeksjon og informere beslutninger om behandling.
Kvantitative sanntids PCR-analyser har høyere sensitivitet, bredere dynamisk område og mer nøyaktig kvantifisering av HBV DNA enn konvensjonelle PCR-teknikker 14,15,16,17. Flere kommersielle sanntids PCR-baserte molekylære diagnostiske sett for kvantifisering av HBV DNA i serum eller plasmaprøver er tilgjengelige i markedet. Her beskriver vi en detaljert arbeidsflyt for påvisning og kvantifisering av HBV DNA i humant serum eller plasma ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig, IVD-merket sanntids PCR-basert sett. Settet er en mye brukt18,19, rimelig, men svært følsom analyse, og ytelsesegenskapene er sammenlignbare med andre kommersielt tilgjengelige CE-merkede sett(er)18. Bortsett fra HBV-målområdeamplifikasjonen, er et endogent internkontrollgen også inkludert i settet for å verifisere kvaliteten på prøver, kvaliteten på ekstrahert DNA, PCR-amplifikasjon og mulig PCR-hemming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien involverte ingen menneskelige deltakere eller kliniske prøver. Det eneste biologiske materialet som ble brukt var den 4. WHO internasjonale standarden for HBV DNA for nukleinsyretest (NIBSC-kode 10/266). Denne standarden er et offentlig tilgjengelig referansemateriale som ikke inneholder personlig informasjon eller identifiserbare data. Som sådan var det ikke nødvendig med etisk godkjenning for denne studien.
1. DNA-ekstraksjon
- Ekstraher virus-DNA fra humant serum eller plasmaprøve. Oppbevar ekstrahert DNA ved -20 °C inntil videre bruk ved PCR.
MERK: Det anbefalte volumet av serum eller plasma for DNA-ekstraksjon er 500 μL, og elueringsvolumet er 50 μL. I denne studien ble det virale DNA ekstrahert ved hjelp av et viralt nukleinsyreekstraksjonssett (Table of Materials).
2. PCR i sanntid
- Tine alle reagensene (tabell 1) i sanntids PCR-settet ved romtemperatur (RT; 15-25 °C) før du starter PCR. Når de er tint, bland komponentene ved pulsvirvel i 10 s med moderat hastighet og sentrifuge ved 8000 × g i 15 s ved RT. Hold alle tinte komponenter på en kjøleblokk.
- Reaksjon forberedelse
- Forbered en PCR-blanding i henhold til tabell 2. Beregn volumet av reagensene som skal tilsettes basert på antall prøver, standarder og ingen malkontroll.
MERK: Ved tilberedning av PCR-blandingen skal minst 10 % ekstra volum av hvert reagens tilsettes (f.eks. hvis 10 reaksjoner er nødvendig, beregn for 11 reaksjoner). - Pipet 15 μL av ovennevnte PCR-blanding i hvert PCR-rør. Deretter tilsettes 15 μL av det ekstraherte prøve-DNA. Legg til 15 μL av minst en av standardene for HBV (HBV Standard 1-5) som en positiv kontroll (PC) for påvisning av HBV DNA og 15 μL PCR-grad nukleasefritt vann som en negativ kontroll (NC). For å generere en standardkurve som kreves for kvantifisering av HBV DNA, bruk alle 5 kvantifiseringsstandardene som følger med settet (HBV Standard 1-5) for hver PCR-kjøring.
- Lukk rørene, bland komponentene ved pulsvirvel i 10 s med moderat hastighet, og sentrifuge ved 8000 × g i 15 s ved RT før du fortsetter til termisk syklist. Forsikre deg om at ingen bobler er i reaksjonsblandingen, da det kan forstyrre fluorescensdeteksjon.
- Forbered en PCR-blanding i henhold til tabell 2. Beregn volumet av reagensene som skal tilsettes basert på antall prøver, standarder og ingen malkontroll.
- Program oppsett
- Programmer termosyklisten ved hjelp av sykkelforholdene som anbefalt i tabell 3.
- Kanal-/fluoroforvalg
- Velg fluorescerende fargestoffer for vanlige PCR-plattformer i sanntid, som nevnt i tabell 4.
- Analyse av data
- Når kjøringen er fullført, analyserer du forsterkningsplottet på en lineær skala.
- Innstilling av terskel
- Sett terskelen innenfor eksponentiell fase av en PCR-reaksjon. Anbefalte terskelverdier for settet er nevnt i tabell 5. Vær konsekvent med terskelinnstillingen. Når den optimale terskelen for analysen er bestemt, bruk den konsekvent for alle prøvene for en bestemt PCR-maskin. Dette vil bidra til å sikre at resultatene er nøyaktige og reproduserbare.
MERK: Hvis terskelen er satt for lavt, kan signalet være under støynivået, og Ct-verdien vil være upålitelig. Hvis terskelen er satt for høyt, kan signalet være i platåfasen av reaksjonen, hvor amplifikasjonen ikke er like effektiv, og Ct-verdien kan være unøyaktig.
- Sett terskelen innenfor eksponentiell fase av en PCR-reaksjon. Anbefalte terskelverdier for settet er nevnt i tabell 5. Vær konsekvent med terskelinnstillingen. Når den optimale terskelen for analysen er bestemt, bruk den konsekvent for alle prøvene for en bestemt PCR-maskin. Dette vil bidra til å sikre at resultatene er nøyaktige og reproduserbare.
- Cutoff
- Kjør settet i 40 forsterkningssykluser. Ikke vurder noen forsterkning utover 38 sykluser for noen tolkning.
- Kvalitativ resultatanalyse
- Bruk settet til kvalitativ påvisning av HBV DNA. Bruk Standard 2 som PC med forventede Ct-verdier ved 20 ± 2 for HBV og 24 ± 3 for IC.
- Forsikre deg om at ingen malkontroll (NTC) ikke viser noen forsterkning for både HBV- og internkontrollmål (IC). Hvis det oppstår en amplifikasjonsreaksjon i NTC-reaksjonen, kan prøveforurensning ha oppstått.
- Siden analysegrensen er 38, bør du vurdere enhver amplifikasjon før 38 Ct for HBV-målet som en HBV-positiv prøve. Når alle kontrollene oppfyller de ovennevnte kravene, bør du vurdere et eksemplar etter tolkningene nevnt i tabell 6.
- Kvantitativ resultatanalyse
- Bruk settet med 5 kvantifiseringsstandarder med kjente konsentrasjoner for HBV-spesifikt DNA som er kalibrert mot den 4. WHO internasjonale standarden for HBV DNA for nukleinsyreamplifikasjonsteknikker (NAT) 20 (tabell 7).
- Bruk disse standardene for å generere en standardkurve. Bruk standardkurven til å kvantifisere HBV-DNA fra en ukjent prøve.
MERK: Sanntids PCR-programvaren vil generere en standardkurve ved hjelp av Ct-verdiene oppnådd for HBV-målene for alle 5 standarder og deres tilsvarende konsentrasjoner i internasjonale enheter per mikroliter (IE / μL). - Tolk bare verdiene for ukjente prøver hvis hellingen av standarder faller mellom -3,1 og -3,6, R2-verdien er mellom 0,99 og 1,0, PCR-effektiviteten er mellom 90% -110% (0,9-1,1), og det er ingen forsterkning i den negative kontrollen.
- Programvaren vil beregne konsentrasjonen av hver HBV-positiv prøve i internasjonale enheter per mikroliter (IE / μL). For å beregne virusmengden (konvertering av IE/μL til internasjonale enheter per milliliter [IE/ml]), bruk følgende ligning:
Resultat (IE/ml) = (resultat [IE/μL] x elueringsvolum [μL])/ samplingsvolum (ml)
MERK: Den 4. WHOs internasjonale standard for HBV DNA, NIBSC-kode 10/266, ble ekstrahert for viral DNA-rensing fra 0,5 ml plasma, eluerte det rensede virale DNA i 50 μL elueringsbuffer og brukt med PCR-settet som referanseprøve sammen med 5 HBV-standardene og NTC. HBV-virusmengden i referanseprøven (NIBSC-kode 10/266) ble beregnet til (6659 IE/μL x 50 μL)/0,5 ml = 6,65 900 IE/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skjematisk diagram over arbeidsflyten for å påvise og kvantifisere HBV DNA fra humant plasma/serum er vist i figur 1. Et forsterkningsplott av Standard 2 (brukt som PC) og NTC for både HBV og IC er vist i figur 2. Figur 3 viser amplifikasjonskurvene for en HBV-positiv prøve, en HBV-negativ prøve og en prøve med PCR-hemming. Forsterkningskurven, Ct-verdi for HBV og oppnådd HBV-konsentrasjon i internasjonale enheter per mikroliter (IE/μL) for NIBSC-koden 10/266 er vist i figur 4. Forsterkningskurver for HBV-målet for alle de 5 HBV-standardene i settet og en representativ standardkurve for det samme er vist i figur 5. Hellingen til standardkurven er -3,361, R2 er 0,99996 og effektiviteten er 0,98. Forsterkningskurver for IC-målet for alle 5 HBV-standardene er vist i figur 6.
Figur 1: Skjematisk diagram over arbeidsflyten for å oppdage og kvantifisere HBV DNA fra humant plasma / serumprøver. Ekstraher viralt DNA fra humant serum / plasmaprøve av HBV-mistenkt person. Forbered PCR-blandingen ved å legge til hver PCR-komponent unntatt mal-DNA / standard (er). Dispenser det i PCR-rør/brønner. Legg til ekstrahert viralt DNA / standard (er) som mal DNA, og lukk PCR-rørene. Last den inn i en PCR-maskin i sanntid, start PCR-kjøringen og analyser resultatet etter at kjøringen er fullført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forsterkningsplott for Standard 2 (brukt som PC) og NTC. Et forsterkningsplott av HBV standard 2 er vist her for både HBV- og IC-målene. For kvalitativ resultatanalyse kan Standard 2 brukes som en positiv kontroll. For NTC ble det ikke observert noen forsterkning for noen av målene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Amplifikasjonsplott for HBV-positiv prøve, HBV-negativ prøve og prøve med PCR-hemming. Her vises amplifikasjonsplott for tre ulike prøver: HBV-positiv (kasus 1), HBV-negativ (kasus 2) og en prøve med PCR-hemmere (kasus 3) er vist her. Når det gjelder den positive HBV-prøven, er begge målene forsterket, mens bare IC ble forsterket for den HBV-negative prøven, og ingen forsterkning for HBV-målet ble observert som forventet. Verken HBV eller IC ble amplifisert for kasus 3, noe som betyr at PCR-hemming oppstod på grunn av PCR-hemmerne som var tilstede i DNA-prøven som ble brukt som PCR-mal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Amplifikasjonskurve, Ct-verdi for HBV og oppnådd HBV-konsentrasjon (IE/μL) for NIBSC-kode 10/266. Ekstrahert viralt DNA av NIBSC-kode 10/266 ble kjørt sammen med de 5 HBV-standardene og NTC. Forsterkningskurven for HBV-målet er vist for NIBSC-koden 10/266-prøven i det øvre panelet. Dens Ct-verdi for HBV er 18,94, og den beregnede konsentrasjonen er 6659 IE / μL, vist i det nedre panelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Forsterkningskurver for HBV-målet for alle 5 HBV-standardene og standardkurven. Forsterkningskurver for HBV-målet (grønn kanal) for alle 5 HBV-standardene vises i det øvre panelet. En standardkurve sammen med hellingen (3,361), R2-verdien (0,99996) og PCR-effektiviteten (0,98) vises i det nedre panelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Forsterkningskurver for IC-målet for alle 5 HBV-standarder. Forsterkningskurver på 5 HBV-standarder for IC (gul kanal) er vist her. Som forventet ser de like ut med lignende Ct-verdier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Forsterkningskurver for HBV-målet for alle 5 HBV-standarder og NTC ble kjørt i tre eksemplarer. Forsterkningsplottene til tre replikater for HBV-målet (grønn kanal) i de 5 HBV-standardene viser lignende resultater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Forsterkningskurver for HBV-målet i NIBSC-kode 10/266, NIBSC-kode 14/198 og dens fem fortynninger. Amplifikasjonskurvene for HBV-målet (grønn kanal) for referanseprøvene NIBSC-kode 10/266, NIBSC-kode 14/198 og dens fem fortynninger (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml, 25 IE/ml og 50 IE/ml) er vist her. Det ble ikke påvist forsterkning for 1,25 IE/ml, mens andre fortynninger viste riktige amplifikasjonskurver før 38 Ct. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagent | Beskrivelse: __________ |
| Multiplex master mix | PCR-buffer, Hot Start Taq DNA-polymerase og andre PCR-komponenter |
| HBV primer probe mix | Primere og sondeblanding for HBV-deteksjon |
| Endogen IC-primerprobeblanding | Primere og sondeblanding for endogen internkontroll (IC) deteksjon |
| Standarder for HBV | · HBV-standard 1 |
| · HBV-standard 2 | |
| · HBV-standard 3 | |
| · HBV-standard 4 | |
| · HBV-standard 5 | |
| Negativ kontroll | PCR-klasse nukleasefritt vann |
Tabell 1: Reagenser som leveres med sanntids PCR-settet og deres beskrivelse
| Reagent | Volum per reaksjon |
| Multiplex master mix | 11 μL |
| HBV primer probe mix | 2 μL |
| Endogen IC-primerprobeblanding | 2 μL |
| Totalt reaksjonsvolum | 15 μL |
Tabell 2: Volum av hvert reagens som skal tilsettes per reaksjon for PCR-blandingspreparat
| Skritt | Temperatur (°є) | Tid | Innsamling av data | Sykluser |
| Innledende denaturering | 94 | 10 min | - | 1 |
| PCR-sykling | 94 | 15 s | - | 40 |
| 55 | 60-årene | På | ||
| 72 | 15 s | - |
Tabell 3: PCR-syklingsforhold
| Mål | Rotor-Gene Q* | CFX 96 | ABI PCR i sanntid# |
| HBV | Grønn | FAM | FAM |
| KI | Gul | HEX | VIC |
| *Oppsett for optimalisering av automatisk gevinst - velg "Utfør optimalisering før 1. anskaffelse" | |||
| #Bare for Applied Biosystems 'sanntids PCR-maskiner, velg ROX som 'Passive Reference' fargestoff under plateoppsett, da masterblandingen av settet inneholder ROX | |||
Tabell 4: Fargevalg for ulike sanntids PCR-plattformer
| PCR-instrument i sanntid | Fargestoffer | Terskelverdiområde§ |
| ABI PCR i sanntid¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| HEX | 50–400 | |
| Rotor-Gene Q | Grønn | 0.015–0.03 |
| Gul | 0.01–0.02 | |
| §En absolutt terskelverdi varierer fra instrument til instrument avhengig av instrumentets alder, modell og kalibreringsstatus | ||
| ¶Disse terskelverdiene gjelder når ROX er valgt som fargestoff for passiv referanse | ||
| †Relativ fluorescens økes med ca. 2 til 5 ganger når Bio-Rads hvite PCR-rør brukes i stedet for klare rør. Så terskelverdien bør bestemmes tilsvarende | ||
Tabell 5: Anbefalte grenseverdier for ulike PCR-plattformer i sanntid
| Type eksempel | Sak | Forsterkningssignal i | Resultat tolkning | |||
| FAM/Grønn | HEX/VIC/Gul | |||||
| Kontroll | Standard 2/PC | Ja (20 ± 2) | Ja (24 ± 3) | Standard 2/PC fungerer som den skal | ||
| NTC | Nei | Nei | NTC fungerer som den skal | |||
| Eksempel | 1 | Ja | Ja / Nei* | HBV-spesifikt DNA påvist | ||
| 2 | Nei | Ja | HBV-spesifikt DNA ikke oppdaget. Prøven inneholder ikke påviselig mengde HBV-spesifikt DNA | |||
| 3 | Nei | Nei | Mulig hemming av PCR, fortynn DNA-prøven (1:10) / re-ekstrahere DNA fra den opprinnelige prøven og gjenta PCR | |||
| *Påvisning av internkontrollen er ikke nødvendig når HBV-målet oppdages. Høy HBV DNA-belastning i prøven kan føre til reduksjon eller fravær av internkontrollsignal | ||||||
Tabell 6: Resultattolkning av positive, negative og PCR-hemmere med prøver av dårlig kvalitet
| Standard | Konsentrasjon (IE/μl) | Ønsket Ct | |
| HBV | KI | ||
| (FAM/ Grønn) | (HEX/VIC/gul) | ||
| HBV-standard 1 | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-standard 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-standard 3 | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-standard 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-standard 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tabell 7: HBV-standarder og konsentrasjon av HBV-målet og ønskede Ct-verdier
| Eksempel | Forventet CT | Oppnådd Ct for HBV | Gjennomsnittlig Ct | Standardavvik | CV % | ||
| Replikere 1 | Replikere 2 | Replikere 3 | |||||
| HBV-standard 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV-standard 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV-standard 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV-standard 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV-standard 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabell 8: Oppnådde Ct-verdier, gjennomsnitt, standardavvik og variasjonskoeffisient (CV%) av 5 HBV-standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIBSC-kode 10/266 har blitt tildelt en enhet på 9,55,000 IE/ml når den rekonstitueres i 0,5 ml nukleasefritt vann i henhold til leverandørinformasjonen21. Dette kan betraktes som en HBV-positiv prøve med høy belastning. HBV-virusmengden bestemt av virusbelastningssettet som ble brukt i denne studien, var 6,65,900 IE / ml (figur 4). Siden DNA-ekstraksjonseffektiviteten til et DNA-ekstraksjonssett ikke er 100%, går noe DNA ofte tapt under renseprosessen. Selv om virusmengden bestemt av settet er litt lavere enn reagenset (NIBSC-kode 10/266) leverandørens tildelte verdi, er dataene likevel tilfredsstillende da log10-forskjellen mellom de to verdiene bare er 0,157 som er mindre enn grenseverdien (0,5) 22.
Virusbelastningssettet som brukes i denne protokollen er svært robust og gir reproduserbare data, som vist i figur 7. I dette eksperimentet ble alle 5 standarder og NTC kjørt i tre eksemplarer, og deres Ct-verdier, gjennomsnitt, standardavvik og variasjonskoeffisient (CV%) er vist i tabell 8. En lavere CV% på mindre enn 1%, som nevnt i tabell 8, indikerer at eksperimentet er mer pålitelig og gir svært nøyaktige resultater.
En referanseprøve med svært lav belastning (NIBSC-kode: 14/198)23 ble brukt sammen med settet for å sjekke LoD. NIBSC-kode 14/198 inneholder mindre enn 50 IE / ml HBV DNA per leverandørinformasjon. DNA ble ekstrahert fra NIBSC-kode 14/198, og flere fortynninger (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml og 25 IE/ml) av DNA ble fremstilt. Settet brukte alle fortynningene og 5 HBV-standarder som mal-DNA. Det ble observert at settet kan oppdage alle fortynninger opp til 2,5 IE / ml HBV DNA (figur 8), og det samsvarer nøyaktig med LoD for virusbelastningssettet. Derfor er virusbelastningssettet et svært følsomt og reproduserbart verktøy som molekylære diagnostiske laboratorier kan bruke til å hjelpe helsepersonell med å diagnostisere og håndtere HBV-infeksjoner effektivt.
Brukere bør huske på følgende kritiske trinn når de utfører prosedyren. Brukerne må bare bruke ekstrahert DNA av høy kvalitet som PCR-mal for å sikre nøyaktige resultater. Det er viktig å unngå flere fryse-tine-sykluser (ikke mer enn 3 ganger) av reagensene. PCR-blandingen bør ikke utsettes for lys i lang tid, da den inneholder den lysfølsomme fluorescerende sonden og passive referansefargestoffet ROX. Det er viktig å alltid inkludere ingen malkontroll og standarder i hver kjøring for å sikre nøyaktigheten og påliteligheten til resultatene. Kalibrerte pipetter med sterile filtrerte spisser må alltid brukes. Mal-DNA og standarder må legges i et eget område med en annen pipette fra reaksjonsprepareringsområdet for å unngå krysskontaminering.
Følgende er noen vanlige feilsøkingstips for sanntids PCR-basert påvisning og kvantifisering av hepatitt B-virus-DNA. Forsterkningssignal under negativ kontroll kan skje på grunn av krysskontaminering under reaksjonsoppsett. Så brukeren bør sjekke om forurensning av settkomponenter. Ingen forsterkningssignal med standarder kan oppstå på grunn av følgende årsaker: (i) Feil PCR-blanding brukt. Brukeren bør sjekke om alle komponenter er tilsatt riktig eller ikke. (ii) Bruk av utløpte reagenser. Brukeren må sjekke utløpsdatoen før reaksjonen settes opp. (iii) Feil oppbevaring av reagenser. Sørg for at reagensene oppbevares ved -20 °C eller lavere og ikke oppbevares lenge ved romtemperatur under reaksjonsoppsett. (iv) Feil PCR-sykkeltilstand ble brukt. I et slikt tilfelle anbefales det å gjenta PCR med riktig program. (iv) Svakt eller intet signal fra internkontrollen for prøver kan oppstå på grunn av høy HBV-belastning i prøven og PCR-hemming. Brukeren kan fortynne DNA-prøven (1:10) og gjenta analysen for høy HBV-belastning i prøven. Ved PCR-hemming må prøve-DNA ekstraheres på nytt med reagenser av god kvalitet, og analysen må gjentas.
Sanntids PCR-basert deteksjon og kvantifisering av hepatitt B-virus-DNA er en svært sensitiv og spesifikk teknikk, men den har noen begrensninger som kostnad og kompleksitet. Sanntids PCR-instrumenter og reagenser kan være dyre, og kostnaden for testing kan være en barriere for noen pasienter og helsevesen. Sanntids PCR er en kompleks teknikk som krever trent personell til å utføre analysen og tolke resultatene. Det er en indirekte måling av virusmengden, så både kvaliteten på standardene og mal-DNA kan påvirke resultatet. Ny genotype av HBV og/eller mutasjon(er) i primersonderegionen kan føre til falske negative resultater.
Sanntids PCR-basert deteksjon og kvantifisering av HBV DNA er en svært sensitiv og spesifikk metode som kan oppdage lave nivåer av viralt DNA. Sammenlignet med andre metoder som serologiske tester (ELISA og lateral flow assay), har sanntids PCR flere fordeler. For det første er det mer følsomt enn de serologiske testene. For det andre kan det kvantifisere mengden HBV-DNA som er tilstede i en prøve, mens serologiske tester bare kan gi et kvalitativt resultat. Endelig er sanntids-PCR mindre utsatt for falske positive enn de serologiske testene24. Samlet sett er sanntids PCR den mest sensitive, spesifikke og kvantitative metoden som er tilgjengelig for påvisning og kvantifisering av HBV DNA. Det er også en relativt rask teknikk, noe som gjør den ideell for klinisk bruk.
Sanntids PCR-basert deteksjon og kvantifisering av hepatitt B-virus-DNA er et kraftig verktøy med flere fremtidige applikasjoner, inkludert utvikling av nye antivirale terapier og pasientnær testing. Teknikken kan brukes til å screene nye antivirale legemidler og for å overvåke effekten av disse legemidlene i kliniske studier. Dette kan føre til utvikling av mer effektive og mindre giftige behandlinger for HBV-infeksjon. Sanntids PCR-instrumenter blir mindre og mer bærbare, noe som gjør det mulig å utføre HBV virusbelastningstesting på pasientstedet. Dette kan forbedre tilgangen til testing og føre til tidligere diagnose og behandling av HBV-infeksjon. Regentene til dette sanntids PCR-baserte settet kan tilpasses med digital PCR for absolutt kvantifisering for mer nøyaktig overvåking av hetteglassbelastningen.
I tillegg til disse spesifikke applikasjonene, vil sanntids PCR-basert deteksjon og kvantifisering av HBV DNA sannsynligvis spille en viktig rolle i forskning og utvikling av nye verktøy og strategier for å forebygge, diagnostisere og behandle HBV-infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er tilknyttet Kilpest India Limited, produsenten av HBV-virusbelastningssettet som ble brukt i denne studien.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita og Shikha for deres tekniske assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
