Summary
A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real é um método sensível e preciso para diagnosticar e monitorar a infecção pelo HBV. Aqui, apresentamos um protocolo para detecção do DNA do VHB e a medição da carga viral de uma amostra.
Abstract
O vírus da hepatite B (VHB) é uma importante causa de doença hepática em todo o mundo. Pode levar a infecções agudas ou crônicas, tornando os indivíduos altamente suscetíveis à cirrose fatal e ao câncer de fígado. A detecção e quantificação precisas do DNA do VHB no sangue são essenciais para o diagnóstico e monitoramento da infecção pelo VHB. O método mais comum para detectar o DNA do VHB é a PCR em tempo real, que pode ser usada para detectar o vírus e avaliar a carga viral para monitorar a resposta à terapia antiviral. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a detecção e quantificação do DNA do VHB em soro ou plasma humano usando um kit baseado em PCR em tempo real marcado com DIV. O kit usa primers e sondas que têm como alvo a região central altamente conservada do genoma do HBV e podem quantificar com precisão todos os genótipos do HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). O kit também inclui um controle interno endógeno para monitorar uma possível inibição da PCR. Este ensaio tem duração de 40 ciclos, e seu ponto de corte é de 38 Ct. Para a quantificação do DNA do VHB em amostras clínicas, um conjunto de 5 padrões de quantificação é fornecido com o kit. Os padrões contêm concentrações conhecidas de DNA específico para HBV que são calibradas de acordo com a4ª Norma Internacional da OMS para DNA de HBV para o teste de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Os padrões são usados para validar a funcionalidade da amplificação de DNA específico para HBV e gerar uma curva padrão, permitindo a quantificação do DNA do HBV em uma amostra. DNA do VHB tão baixo quanto 2,5 UI/mL foi detectado usando o kit de PCR. A alta sensibilidade e reprodutibilidade do kit o tornam uma ferramenta poderosa em laboratórios clínicos, auxiliando os profissionais de saúde no diagnóstico e manejo efetivo das infecções por HBV.
Introduction
O vírus da hepatite B (VHB) é um vírus de DNA parcialmente de fita dupla do gênero Orthohepadnavirus e da família Hepadnaviridae 1. Pode desencadear uma infecção crônica que persiste por toda a vida, podendo levar à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular2,3,4. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), uma população estimada de 296 milhões de pessoas vivia com infecção crônica por hepatite B em 2019, e 1,5 milhão de pessoas foram infectadas a cada ano5.
A identificação e a dosagem do DNA do VHB em amostras de soro ou plasma servem como um método valioso para detectar indivíduos com infecção contínua pelo vírus da hepatite B, avaliar a eficácia do tratamento antiviral e predizer a probabilidade de sucesso do tratamento 6,7,8,9,10,11. A alta carga viral está associada a um risco aumentado de progressão da doença hepática, incluindo cirrose e câncer hepático12,13. Assim, a mensuração precisa da carga viral é crucial para acompanhar a progressão da infecção pelo VHB e informar as decisões sobre o tratamento.
Ensaios quantitativos de PCR em tempo real apresentam maior sensibilidade, maior faixa dinâmica e quantificação mais precisa do DNA do VHB do que as técnicas convencionais de PCR 14,15,16,17. Vários kits comerciais de diagnóstico molecular baseados em PCR em tempo real para a quantificação do DNA do VHB em amostras de soro ou plasma estão disponíveis no mercado. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho detalhado para a detecção e quantificação do DNA do HBV em soro ou plasma humano usando um kit baseado em PCR em tempo real marcado com IVD disponível comercialmente. O kit é um ensaio amplamenteutilizado18,19, de baixo custo, porém altamente sensível, e suas características de desempenho são comparáveis a outros kits com marcação CE disponíveis comercialmente18. Além da amplificação da região-alvo do VHB, um gene de controle interno endógeno também está incluído no kit para verificar a qualidade das amostras, qualidade do DNA extraído, amplificação por PCR e possível inibição da PCR.
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Protocol
Este estudo não envolveu nenhum participante humano ou amostras clínicas. O único material biológico utilizado foi a4ª Norma Internacional da OMS para DNA do VHB para teste de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Esta norma é um material de referência disponível publicamente que não contém quaisquer informações pessoais ou dados identificáveis. Dessa forma, não foi necessária aprovação ética para este estudo.
1. Extração de DNA
- Extrair o ADN viral de amostras de soro ou plasma humanos. Conservar o ADN extraído a -20 °C até nova utilização na PCR.
NOTA: O volume recomendado de soro ou plasma para extração de DNA é de 500 μL, e o volume de eluição é de 50 μL. Neste estudo, o DNA viral foi extraído usando um kit de extração de ácido nucleico viral (Tabela de Materiais).
2. PCR em tempo real
- Descongelar todos os reagentes (Tabela 1) do kit de PCR em tempo real à temperatura ambiente (TR; 15-25 °C) antes de iniciar a PCR. Quando descongelados, misture os componentes por vórtice de pulso por 10 s a uma velocidade moderada e centrifuja a 8.000 × g por 15 s em RT. Mantenha todos os componentes descongelados em um bloco de resfriamento.
- Preparação da reação
- Preparar uma mistura de PCR de acordo com a Tabela 2. Calcule o volume dos reagentes a serem adicionados com base no número de amostras, padrões e nenhum controle de modelo.
NOTA: Ao preparar a mistura de PCR, pelo menos 10% de volume extra de cada reagente deve ser adicionado (por exemplo, se forem necessárias 10 reações, calcular para 11 reações). - Pipetar 15 μL da mistura de PCR acima preparada em cada tubo de PCR. Em seguida, adicione 15 μL do DNA da amostra extraída. Adicionar 15 μL de pelo menos um dos padrões para HBV (HBV Standard 1-5) como controle positivo (PC) para detecção de DNA do HBV e 15 μL de água livre de nuclease grau PCR como controle negativo (NC). Para gerar uma curva padrão necessária para a quantificação do DNA do HBV, use todos os 5 padrões de quantificação fornecidos com o kit (HBV Standard 1-5) para cada execução de PCR.
- Feche os tubos, misture os componentes por vórtice de pulso por 10 s a uma velocidade moderada e centrifuja a 8.000 × g por 15 s em RT antes de prosseguir para o termociclador. Certifique-se de que não há bolhas na mistura de reação, pois isso pode interferir na detecção de fluorescência.
- Preparar uma mistura de PCR de acordo com a Tabela 2. Calcule o volume dos reagentes a serem adicionados com base no número de amostras, padrões e nenhum controle de modelo.
- Configuração do programa
- Programe o termociclador utilizando as condições de ciclagem recomendadas na Tabela 3.
- Seleção de Canais/Fluoróforos
- Selecione os corantes fluorescentes para as plataformas de PCR em tempo real comumente usadas, conforme mencionado na Tabela 4.
- Análise de dados
- Após o término da execução, analise o gráfico de amplificação em escala linear.
- Definição de limite
- Defina o limite dentro da fase exponencial de uma reação de PCR. Os valores limite recomendados para o kit são mencionados na Tabela 5. Seja consistente com a configuração de limite. Uma vez determinado o limiar ideal para o ensaio, use-o consistentemente para todas as amostras de uma máquina de PCR específica. Isso ajudará a garantir que os resultados sejam precisos e reproduzíveis.
Observação : se o limite for definido muito baixo, o sinal pode estar abaixo do nível de ruído e o valor Ct não será confiável. Se o limiar for definido muito alto, o sinal pode estar na fase de platô da reação, onde a amplificação não é tão eficiente, e o valor de Ct pode ser impreciso.
- Defina o limite dentro da fase exponencial de uma reação de PCR. Os valores limite recomendados para o kit são mencionados na Tabela 5. Seja consistente com a configuração de limite. Uma vez determinado o limiar ideal para o ensaio, use-o consistentemente para todas as amostras de uma máquina de PCR específica. Isso ajudará a garantir que os resultados sejam precisos e reproduzíveis.
- Corte
- Execute o kit para 40 ciclos de amplificação. Não considere qualquer amplificação além de 38 ciclos para qualquer interpretação.
- Análise qualitativa dos resultados
- Use o kit para detecção qualitativa do DNA do HBV. Use o padrão 2 como PC com valores esperados de Ct em 20 ± 2 para HBV e 24 ± 3 para IC.
- Certifique-se de que nenhum controle de modelo (NTC) não exiba nenhuma amplificação para os alvos HBV e de controle interno (IC). Se ocorrer uma reação de amplificação na reação NTC, pode ter ocorrido contaminação da amostra.
- Como o ponto de corte do ensaio é 38, considere qualquer amplificação antes de 38 Ct para o alvo do HBV como uma amostra positiva para HBV. Quando todos os controles atenderem aos requisitos acima mencionados, considere um espécime seguindo as interpretações mencionadas na Tabela 6.
- Análise quantitativa dos resultados
- Utilizar o conjunto de 5 padrões de quantificação de concentrações conhecidas para DNA específico do HBV que são calibrados de acordo com o 4º padrão internacional da OMS para DNA do HBV para técnicas de amplificação de ácidos nucleicos (NAT)20 (Tabela 7).
- Utilize esses padrões para gerar uma curva padrão. Utilizar a curva padrão para quantificar o DNA do VHB de uma amostra desconhecida.
NOTA: O software de PCR em tempo real irá gerar uma curva padrão usando os valores de Ct obtidos para os alvos de HBV de todos os 5 padrões e suas concentrações correspondentes em unidades internacionais por microlitro (UI/μL). - Somente interpretar os valores para amostras desconhecidas se a inclinação dos padrões estiver entre -3,1 e -3,6, o valor de R2 estiver entre 0,99 e 1,0, a eficiência da PCR estiver entre 90%-110% (0,9-1,1) e não houver amplificação no controle negativo.
- O software calculará a concentração de cada amostra positiva para HBV em unidades internacionais por microlitro (UI/μL). Para calcular a carga viral (conversão de UI/μL em unidades internacionais por mililitro [UI/mL]), use a seguinte equação:
Resultado (UI/mL) = (Resultado [UI/μL] x Volume de Eluição [μL])/ Volume da Amostra (mL)
NOTA: A4ª Norma Internacional da OMS para DNA DO HBV, código NIBSC 10/266, foi extraída para purificação do DNA viral a partir de 0,5 mL de plasma, eluída do DNA viral purificado em 50 μL de tampão de eluição e usada com o kit de PCR como amostra de referência, juntamente com os 5 padrões de HBV e NTC. A carga viral do VHB da amostra de referência (código NIBSC 10/266) foi calculada como (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65,900 UI/mL.
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Representative Results
Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho para detectar e quantificar o DNA do VHB a partir do plasma/soro humano é mostrado na Figura 1. Um gráfico de amplificação do padrão 2 (usado como PC) e NTC para HBV e IC é mostrado na Figura 2. A Figura 3 mostra as curvas de amplificação para uma amostra positiva para HBV, uma amostra negativa para HBV e uma amostra com inibição da PCR. A curva de amplificação, o valor de Ct para o VHB e a concentração de VHB obtida em unidades internacionais por microlitro (UI/μL) para o código NIBSC 10/266 estão apresentados na Figura 4. As curvas de amplificação para o alvo do HBV de todos os 5 padrões de HBV do kit e uma curva padrão representativa para o mesmo são mostradas na Figura 5. A inclinação da curva padrão é de -3,361, R2 é de 0,99996 e a eficiência é de 0,98. As curvas de amplificação para o alvo CI de todos os 5 padrões de HBV são mostradas na Figura 6.
Figura 1: Diagrama esquemático do fluxo de trabalho para detectar e quantificar o DNA do VHB a partir de amostras de plasma/soro humano. Extrair DNA viral de amostra de soro/plasma humano de indivíduo suspeito de HBV. Prepare a mistura de PCR adicionando cada componente de PCR, exceto o modelo DNA/padrão(s). Distribua-o em tubos/poços de PCR. Adicione o(s) DNA/padrão(s) viral(is) extraído(s) como o DNA do modelo e feche os tubos de PCR. Carregue-o em uma máquina de PCR em tempo real, inicie a execução do PCR e analise o resultado após a conclusão da execução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Gráfico de amplificação do Padrão 2 (utilizado como CP) e NTC. Um gráfico de amplificação do HBV padrão 2 é mostrado aqui para ambos os alvos HBV e IC. Para a análise qualitativa dos resultados, o Padrão 2 pode ser utilizado como controle positivo. Para NTC, nenhuma amplificação foi observada para nenhum dos alvos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráficos de amplificação para amostra positiva para HBV, amostra negativa para HBV e amostra com inibição da PCR. Gráficos de amplificação para três amostras diferentes: HBV positivo (Caso 1), HBV negativo (Caso 2) e uma amostra contendo inibidores de PCR (Caso 3) são mostrados aqui. No caso da amostra positiva para HBV, ambos os alvos são amplificados, enquanto apenas IC foi amplificado para a amostra HBV negativa, e nenhuma amplificação para o alvo HBV foi observada como esperado. Nem o HBV nem o CI foram amplificados para o Caso 3, o que significa que a inibição da PCR ocorreu devido aos inibidores da PCR presentes na amostra de DNA usada como molde de PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curva de amplificação, valor de Ct para o VHB e concentração de VHB obtida (UI/μL) para o código NIBSC 10/266. O DNA viral extraído do código NIBSC 10/266 foi executado juntamente com os padrões 5 HBV e NTC. A curva de amplificação para o alvo do HBV é mostrada para a amostra do código NIBSC 10/266 no painel superior. Seu valor de Ct para o HBV é de 18,94, e a concentração calculada é de 6659 UI/μL, mostrada no painel inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Curvas de amplificação para o alvo do HBV de todos os 5 padrões de HBV e da curva padrão. As curvas de amplificação para o alvo do HBV (canal verde) de todos os 5 padrões de HBV são mostradas no painel superior. Uma curva padrão juntamente com sua inclinação (3,361), valor de R2 (0,99996) e eficiência de PCR (0,98) são mostrados no painel inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Curvas de amplificação para o alvo do CI de todos os 5 padrões de HBV. Curvas de amplificação de 5 padrões de HBV para o CI (canal amarelo) são mostradas aqui. Como esperado, eles parecem os mesmos com valores Ct semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: As curvas de amplificação para o alvo do HBV de todos os 5 padrões de HBV e NTC foram executadas em triplicata. Os gráficos de amplificação de três repetições para o alvo do HBV (canal verde) dos 5 padrões HBV mostram resultados semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Curvas de amplificação para o alvo do VHB do NIBSC código 10/266, NIBSC código 14/198 e suas cinco diluições. As curvas de amplificação para o alvo do VHB (canal verde) das amostras de referência NIBSC código 10/266, NIBSC código 14/198 e suas cinco diluições (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL, 25 UI/mL e 50 UI/mL) são mostradas aqui. Nenhuma amplificação foi detectada para 1,25 UI/mL, enquanto outras diluições mostraram curvas de amplificação adequadas antes de 38 Ct. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Descrição: __________ |
| Mix mestre multiplex | Tampão de PCR, Taq Taq DNA polimerase de início a quente e outros componentes de PCR |
| Mistura de sonda de primer HBV | Primers e mistura de sonda para detecção de HBV |
| Mistura endógena de sonda de primers IC | Primers e mistura de sonda para detecção de controle interno endógeno (CI) |
| Padrões para HBV | · HBV Padrão 1 |
| · HBV Padrão 2 | |
| · HBV Padrão 3 | |
| · HBV Padrão 4 | |
| · HBV Padrão 5 | |
| Controle Negativo | Água livre de nuclease grau PCR |
Tabela 1: Reagentes fornecidos com o kit de PCR em tempo real e sua descrição
| Reagente | Volume por reação |
| Mix mestre multiplex | 11 μL |
| Mistura de sonda de primer HBV | 2 μL |
| Mistura endógena de sonda de primers IC | 2 μL |
| Volume total de reação | 15 μL |
Tabela 2: Volume de cada reagente a ser adicionado por reação para a preparação da mistura de PCR
| Passo | Temperatura (°С) | Hora | Recolha de dados | Ciclos |
| Desnaturação Inicial | 94 | 10 minutos | - | 1 |
| Ciclo de PCR | 94 | 15 s | - | 40 |
| 55 | Anos 60 | Em | ||
| 72 | 15 s | - |
Tabela 3: Condições de ciclagem da PCR
| Alvo | Rotor-Gene Q* | CFX 96 | | ABI PCR# em tempo real |
| HBV | Verde | FAM | FAM |
| IC | Amarelo | ENFEITIÇAR | VIC |
| *Configuração de otimização de ganho automático - selecione "Executar otimização antes da 1ª aquisição" | |||
| #Somente para as máquinas de PCR em tempo real da Applied Biosystems, selecione ROX como o corante 'Referência passiva' durante a configuração da placa, pois a mistura mestre do kit contém ROX | |||
Tabela 4: Seleção de corantes para diferentes plataformas de PCR em tempo real
| Instrumento de PCR em Tempo Real | Corantes | Intervalo de valores limiares§ |
| ABI PCR¶ em tempo real | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| ENFEITIÇAR | 50–400 | |
| Rotor-Gene Q | Verde | 0.015–0.03 |
| Amarelo | 0.01–0.02 | |
| §Um valor de limiar absoluto varia de instrumento para instrumento, dependendo da idade, modelo e estado de calibração do instrumento | ||
| ¶Esses valores limite são aplicáveis quando o ROX é selecionado como o corante 'Referência passiva' | ||
| †A fluorescência relativa é aumentada em cerca de 2 a 5 vezes quando os tubos de PCR brancos da Bio-Rad são usados em vez de tubos transparentes. Assim, o valor limite deve ser determinado em conformidade | ||
Tabela 5: Valores limite recomendados para diferentes plataformas de PCR em tempo real
| Tipo de amostra | Caso | Sinal de amplificação em | Interpretação dos Resultados | |||
| FAM/Verde | HEX/VIC/Amarelo | |||||
| Controle | Padrão 2/PC | Sim (20 ± 2) | Sim (24 ± 3) | Padrão 2/PC está funcionando corretamente | ||
| NTC | Não | Não | NTC está funcionando corretamente | |||
| Amostra | 1 | Sim | Sim / Não* | DNA específico do VHB detectado | ||
| 2 | Não | Sim | DNA específico do HBV não detectado. A amostra não contém quantidade detectável de DNA específico do HBV | |||
| 3 | Não | Não | Possível inibição da PCR, diluir a amostra de DNA (1:10) / re-extrair o DNA da amostra original e repetir a PCR | |||
| *A detecção do Controle Interno não é necessária quando o alvo do HBV é detectado. Alta carga de DNA do HBV na amostra pode levar à redução ou ausência do sinal de Controle Interno | ||||||
Tabela 6: Interpretação dos resultados dos inibidores positivos, negativos e da PCR contendo amostras de baixa qualidade
| Padrão | Concentração (UI/μl) | Ct desejado | |
| HBV | IC | ||
| (FAM/ Verde) | (HEX/VIC/Amarelo) | ||
| HBV Padrão 1 | 5 x 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Padrão 2 | 5 x 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Padrão 3 | 5 x 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Padrão 4 | 5 x 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Padrão 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tabela 7: Padrões de HBV e sua concentração dos valores alvo e Ct desejados
| Amostra | Ct Esperado | Ct obtido para HBV | Ct médio | Desvio padrão | CV % | ||
| Replicar 1 | Réplica 2 | Réplica 3 | |||||
| HBV Padrão 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV Padrão 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV Padrão 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV Padrão 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV Padrão 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabela 8: Obtidos valores de Ct, média, desvio padrão e coeficiente de variação (CV%) de 5 Padrões de VHB.
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Discussion
O código NIBSC 10/266 recebeu uma unidade de 9,55.000 UI/mL quando reconstituída em 0,5 mL de água livre de nucleases, de acordo com as informações do fornecedor21. Esta pode ser considerada uma amostra positiva para VHB de alta carga. A carga viral do VHB determinada pelo kit de carga viral utilizado neste estudo foi de 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Como a eficiência de extração de DNA de qualquer kit de extração de DNA não é de 100%, parte do DNA é frequentemente perdida durante o processo de purificação. Embora a carga viral determinada pelo kit seja um pouco inferior ao valor atribuído pelo fornecedor do reagente (código NIBSC 10/266), ainda assim os dados são satisfatórios, pois a diferença log10 entre os dois valores é de apenas 0,157, que é menor que o valor de corte (0,5)22.
O kit de carga viral utilizado neste protocolo é altamente robusto e fornece dados reprodutíveis, como mostra a Figura 7. Neste experimento, todos os 5 padrões e NTC foram executados em triplicata, e seus valores de Ct, média, desvio padrão e coeficiente de variação (CV%) são mostrados na Tabela 8. Um CV% menor, inferior a 1%, como mencionado na Tabela 8, indica que o experimento é mais confiável e produz resultados altamente precisos.
Uma amostra de referência de carga muito baixa (código NIBSC: 14/198)23 foi usada com o kit para verificar sua LoD. O código NIBSC 14/198 contém menos de 50 UI/mL de DNA do HBV de acordo com as informações do fornecedor. O DNA foi extraído do NIBSC código 14/198, e múltiplas diluições (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL e 25 UI/mL) do DNA foram preparadas. O kit utilizou todas as diluições e 5 padrões de HBV como molde de DNA. Observou-se que esse kit é capaz de detectar todas as diluições até 2,5 UI/mL de DNA do VHB (Figura 8), e corresponde exatamente ao LoD do kit de carga viral. Assim, o kit de carga viral é uma ferramenta altamente sensível e reprodutível que os laboratórios de diagnóstico molecular podem usar para ajudar os profissionais de saúde a diagnosticar e gerenciar infecções pelo HBV de forma eficaz.
Os usuários devem ter em mente as seguintes etapas críticas ao executar o procedimento. Os usuários devem empregar apenas DNA extraído de alta qualidade como modelo de PCR para garantir resultados precisos. É importante evitar múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento (não mais de 3 vezes) dos reagentes. A mistura de PCR não deve ser exposta à luz por muito tempo, pois contém a sonda fluorescente sensível à luz e o corante de referência passivo ROX. É fundamental sempre incluir nenhum controle de modelo e padrões em cada execução para garantir a precisão e a confiabilidade dos resultados. Pipetas calibradas com pontas filtradas estéreis devem ser usadas sempre. O ADN do modelo e as normas devem ser adicionados numa área separada com uma pipeta diferente da área de preparação da reacção para evitar a contaminação cruzada.
A seguir estão algumas dicas comuns de solução de problemas para detecção e quantificação baseadas em PCR em tempo real do DNA do vírus da hepatite B. O sinal de amplificação no controle negativo pode ocorrer devido à contaminação cruzada durante a configuração da reação. Assim, o usuário deve verificar se há contaminação dos componentes do kit. Nenhum sinal de amplificação com padrões pode ocorrer devido aos seguintes motivos: (i) Mistura de PCR incorreta usada. O usuário deve verificar se todos os componentes foram adicionados corretamente ou não. (ii) Uso de reagentes expirados. O usuário deve verificar a data de validade antes que a reação seja configurada. (iii) Armazenamento inadequado de reagentes. Certifique-se de que os reagentes são armazenados a -20 °C ou menos e não são mantidos à temperatura ambiente durante um longo período de tempo durante a configuração da reação. (iv) Foi utilizada condição errada de ciclagem por PCR. Nesse caso, recomenda-se repetir o PCR com o programa correto. (iv) Pode ocorrer fraco ou nenhum sinal do controle interno para amostras devido à alta carga de HBV na amostra e inibição da PCR. O usuário poderia diluir a amostra de DNA (1:10) e repetir o ensaio para alta carga de HBV na amostra. No caso de inibição da PCR, o DNA da amostra deve ser reextraído com reagentes de boa qualidade, e o ensaio deve ser repetido.
A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B baseada em PCR em tempo real é uma técnica muito sensível e específica, mas tem algumas limitações, como custo e complexidade. Instrumentos e reagentes de PCR em tempo real podem ser caros, e o custo dos testes pode ser uma barreira para alguns pacientes e sistemas de saúde. A PCR em tempo real é uma técnica complexa que requer pessoal treinado para realizar o ensaio e interpretar os resultados. É uma medida indireta da carga viral, portanto, tanto a qualidade dos padrões quanto o DNA do molde podem influenciar o resultado. Um novo genótipo do VHB e/ou mutação(ões) na região do primer-sonda pode levar a resultados falso-negativos.
A detecção e quantificação do DNA do VHB baseada em PCR em tempo real é um método altamente sensível e específico que pode detectar baixos níveis de DNA viral. Em comparação com outros métodos, como testes sorológicos (ELISA e teste de fluxo lateral), a PCR em tempo real tem várias vantagens. Em primeiro lugar, é mais sensível do que os testes sorológicos. Em segundo lugar, pode quantificar a quantidade de DNA do VHB presente em uma amostra, enquanto os testes sorológicos só podem fornecer um resultado qualitativo. Finalmente, a PCR em tempo real é menos propensa a falsos positivos do que os testes sorológicos24. Em geral, a PCR em tempo real é o método mais sensível, específico e quantitativo disponível para a detecção e quantificação do DNA do HBV. É também uma técnica relativamente rápida, o que a torna ideal para uso clínico.
A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B baseada em PCR em tempo real é uma ferramenta poderosa com várias aplicações futuras, incluindo o desenvolvimento de novas terapias antivirais e testes no ponto de atendimento. A técnica pode ser usada para rastrear novos medicamentos antivirais e monitorar a eficácia desses medicamentos em ensaios clínicos. Isso poderia levar ao desenvolvimento de tratamentos mais eficazes e menos tóxicos para a infecção pelo HBV. Os instrumentos de PCR em tempo real estão se tornando menores e mais portáteis, tornando possível a realização de testes de carga viral do HBV no ponto de atendimento. Isso poderia melhorar o acesso aos testes e levar a um diagnóstico e tratamento mais precoces da infecção pelo HBV. Os regentes deste kit baseado em PCR em tempo real podem ser adaptados com PCR digital para quantificação absoluta para monitoramento mais preciso da carga do frasco.
Além dessas aplicações específicas, a detecção e quantificação do DNA do HBV por PCR em tempo real provavelmente desempenhará um papel importante na pesquisa e no desenvolvimento de novas ferramentas e estratégias para prevenir, diagnosticar e tratar a infecção pelo HBV.
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Disclosures
Os autores estão associados à Kilpest India Limited, fabricante do kit de carga viral do HBV usado neste estudo.
Acknowledgments
Agradecemos a Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita e Shikha por sua assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
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