Summary
La detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real es un método sensible y preciso para diagnosticar y controlar la infección por el VHB. Aquí, presentamos un protocolo para la detección de ADN del VHB y la medición de la carga viral de una muestra.
Abstract
El virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de enfermedad hepática en todo el mundo. Puede provocar infecciones agudas o crónicas, lo que hace que las personas sean muy susceptibles a la cirrosis mortal y al cáncer de hígado. La detección y cuantificación precisas del ADN del VHB en la sangre son esenciales para el diagnóstico y el seguimiento de la infección por el VHB. El método más común para detectar el ADN del VHB es la PCR en tiempo real, que se puede utilizar para detectar el virus y evaluar la carga viral para monitorear la respuesta a la terapia antiviral. Aquí, describimos un protocolo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD. El kit utiliza cebadores y sondas que se dirigen a la región central altamente conservada del genoma del VHB y pueden cuantificar con precisión todos los genotipos del VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I y J). El kit también incluye un control interno endógeno para monitorizar la posible inhibición de la PCR. Este ensayo tiene una duración de 40 ciclos y su punto de corte es de 38 Ct. Para la cuantificación del ADN del VHB en muestras clínicas, se proporciona un conjunto de 5 patrones de cuantificación con el kit. Los patrones contienen concentraciones conocidas de ADN específico del VHB que están calibradas con respecto al4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Los patrones se utilizan para validar la funcionalidad de la amplificación de ADN específica del VHB y para generar una curva estándar, que permite la cuantificación del ADN del VHB en una muestra. El ADN del VHB tan bajo como 2,5 UI/ml se detectó utilizando el kit de PCR. La alta sensibilidad y reproducibilidad del kit lo convierten en una poderosa herramienta en los laboratorios clínicos, ayudando a los profesionales de la salud a diagnosticar y manejar eficazmente las infecciones por VHB.
Introduction
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN parcialmente bicatenario del género Orthohepadnavirus y de la familia Hepadnaviridae 1. Puede desencadenar una infección crónica que persiste durante toda la vida, lo que puede conducir a cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular 2,3,4. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que en 2019 una población de 296 millones de personas vivía con una infección crónica por hepatitis B, y 1,5 millones de personas se infectaban cada año5.
La identificación y medición del ADN del VHB en muestras de suero o plasma sirve como un método valioso para detectar individuos con una infección continua por hepatitis B, evaluar la eficacia del tratamiento antiviral y predecir la probabilidad de éxito del tratamiento 6,7,8,9,10,11. La carga viral alta se asocia con un mayor riesgo de progresión de la enfermedad hepática, incluida la cirrosis y el cáncer de hígado12,13. Por lo tanto, la medición precisa de la carga viral es crucial para rastrear la progresión de la infección por VHB e informar las decisiones sobre el tratamiento.
Los ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real tienen mayor sensibilidad, un rango dinámico más amplio y una cuantificación más precisa del ADN del VHB que las técnicas de PCR convencionales 14,15,16,17. En el mercado existen varios kits comerciales de diagnóstico molecular basados en PCR en tiempo real para la cuantificación del ADN del VHB en muestras de suero o plasma. Aquí, describimos un flujo de trabajo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD disponible comercialmente. El kit es un ensayo18,19 ampliamente utilizado, de bajo costo, pero altamente sensible, y sus características de rendimiento son comparables con otros kits con marcado CE disponibles comercialmente18. Además de la amplificación de la región diana del VHB, también se incluye en el kit un gen de control interno endógeno para verificar la calidad de las muestras, la calidad del ADN extraído, la amplificación por PCR y la posible inhibición por PCR.
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Protocol
En este estudio no participaron participantes humanos ni muestras clínicas. El único material biológico utilizado fue el4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Esta norma es un material de referencia disponible públicamente que no contiene ninguna información personal ni datos identificables. Por lo tanto, no se requirió aprobación ética para este estudio.
1. Extracción de ADN
- Extraer el ADN viral de una muestra de suero o plasma humano. Almacenar el ADN extraído a -20 °C hasta su uso posterior en PCR.
NOTA: El volumen recomendado de suero o plasma para la extracción de ADN es de 500 μL y el volumen de elución es de 50 μL. En este estudio, el ADN viral se extrajo utilizando un kit de extracción de ácido nucleico viral (Tabla de Materiales).
2. PCR en tiempo real
- Descongelar todos los reactivos (Tabla 1) del kit de PCR en tiempo real a temperatura ambiente (RT; 15-25 °C) antes de iniciar la PCR. Cuando se descongelen, mezcle los componentes mediante vórtice de pulsos durante 10 s a una velocidad moderada y centrifugue a 8.000 × g durante 15 s a RT. Mantenga todos los componentes descongelados en un bloque de enfriamiento.
- Preparación de la reacción
- Prepare una mezcla de PCR de acuerdo con la Tabla 2. Calcule el volumen de los reactivos que se van a añadir en función del número de muestras, los patrones y la ausencia de control de plantilla.
NOTA: Al preparar la mezcla de PCR, se debe agregar al menos un 10% de volumen adicional de cada reactivo (por ejemplo, si se requieren 10 reacciones, calcule para 11 reacciones). - Pipetear 15 μL de la mezcla de PCR preparada anteriormente en cada tubo de PCR. A continuación, añadir 15 μL del ADN de la muestra extraída. Agregue 15 μL de al menos uno de los patrones para el VHB (Estándar 1-5 del VHB) como control positivo (PC) para detectar el ADN del VHB y 15 μL de agua libre de nucleasas de grado PCR como control negativo (NC). Para generar una curva estándar necesaria para la cuantificación del ADN del VHB, utilice los 5 estándares de cuantificación suministrados con el kit (Estándar 1-5 del VHB) para cada ejecución de PCR.
- Cierre los tubos, mezcle los componentes mediante vórtice de pulso durante 10 s a una velocidad moderada y centrifugue a 8.000 × g durante 15 s a RT antes de pasar al termociclador. Asegúrese de que no haya burbujas en la mezcla de reacción, ya que puede interferir con la detección de fluorescencia.
- Prepare una mezcla de PCR de acuerdo con la Tabla 2. Calcule el volumen de los reactivos que se van a añadir en función del número de muestras, los patrones y la ausencia de control de plantilla.
- Configuración del programa
- Programe el termociclador utilizando las condiciones de ciclo recomendadas en la Tabla 3.
- Selección de canal/fluoróforo
- Seleccione los colorantes fluorescentes para las plataformas de PCR en tiempo real de uso común, como se menciona en la Tabla 4.
- Análisis de datos
- Una vez completada la ejecución, analice el gráfico de amplificación a escala lineal.
- Ajuste de umbral
- Establezca el umbral dentro de la fase exponencial de una reacción de PCR. Los valores umbral recomendados para el kit se mencionan en la Tabla 5. Sea coherente con la configuración del umbral. Una vez que se determina el umbral óptimo para el ensayo, utilícelo de manera consistente para todas las muestras de una máquina de PCR en particular. Esto ayudará a garantizar que los resultados sean precisos y reproducibles.
NOTA: Si el umbral se establece demasiado bajo, la señal puede estar por debajo del nivel de ruido y el valor de Ct no será confiable. Si el umbral se establece demasiado alto, la señal puede estar en la fase de meseta de la reacción, donde la amplificación no es tan eficiente, y el valor de Ct puede ser inexacto.
- Establezca el umbral dentro de la fase exponencial de una reacción de PCR. Los valores umbral recomendados para el kit se mencionan en la Tabla 5. Sea coherente con la configuración del umbral. Una vez que se determina el umbral óptimo para el ensayo, utilícelo de manera consistente para todas las muestras de una máquina de PCR en particular. Esto ayudará a garantizar que los resultados sean precisos y reproducibles.
- Atajo
- Ejecute el kit durante 40 ciclos de amplificación. No considere ninguna amplificación más allá de 38 ciclos para cualquier interpretación.
- Análisis cualitativo de resultados
- Utilice el kit para la detección cualitativa del ADN del VHB. Utilice el estándar 2 como PC con valores esperados de Ct de 20 ± 2 para el VHB y de 24 ± 3 para el CI.
- Asegúrese de que ningún control de plantilla (NTC) no muestre ninguna amplificación para los objetivos de VHB y control interno (IC). Si se produce una reacción de amplificación en la reacción NTC, es posible que se haya producido contaminación de la muestra.
- Dado que el punto de corte del ensayo es 38, considere cualquier amplificación antes de 38 Ct para la diana del VHB como una muestra positiva para el VHB. Cuando todos los controles cumplan con los requisitos antes mencionados, considere una muestra siguiendo las interpretaciones mencionadas en la Tabla 6.
- Análisis cuantitativo de resultados
- Utilice el conjunto de 5 patrones de cuantificación de concentraciones conocidas para el ADN específico del VHB que están calibrados con respecto al 4º estándar internacional de la OMS para el ADN del VHB para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT)20 (Tabla 7).
- Emplee estos estándares para generar una curva estándar. Utilice la curva estándar para cuantificar el ADN del VHB de una muestra desconocida.
NOTA: El software de PCR en tiempo real generará una curva patrón utilizando los valores de Ct obtenidos para los objetivos de VHB de los 5 patrones y sus correspondientes concentraciones en unidades internacionales por microlitro (UI/μL). - Solo interprete los valores para muestras desconocidas si la pendiente de los patrones se encuentra entre -3.1 y -3.6, el valor de R2 está entre 0.99 y 1.0, la eficiencia de la PCR está entre el 90% y el 110% (0.9-1.1) y no hay amplificación en el control negativo.
- El software calculará la concentración de cada muestra positiva para el VHB en unidades internacionales por microlitro (UI/μL). Para calcular la carga viral (conversión de UI/μL a unidades internacionales por mililitro [UI/mL]), utilice la siguiente ecuación:
Resultado (UI/mL) = (Resultado [UI/μL] x Volumen de elución [μL])/ Volumen de la muestra (mL)
NOTA: El4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB, código NIBSC 10/266, se extrajo para la purificación del ADN viral de 0,5 ml de plasma, se eluyó el ADN viral purificado en 50 μl de tampón de elución y se utilizó con el kit de PCR como muestra de referencia junto con los 5 estándares del VHB y NTC. La carga viral del VHB de la muestra de referencia (código NIBSC 10/266) se calculó como (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65,900 UI/mL.
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Representative Results
En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático del flujo de trabajo para detectar y cuantificar el ADN del VHB a partir de plasma/suero humano. En la Figura 2 se muestra un gráfico de amplificación del Estándar 2 (utilizado como PC) y NTC tanto para el VHB como para el CI. La Figura 3 muestra las curvas de amplificación para una muestra positiva para el VHB, una muestra negativa para el VHB y una muestra con inhibición por PCR. En la Figura 4 se muestran la curva de amplificación, el valor de Ct para el VHB y la concentración obtenida del VHB en unidades internacionales por microlitro (UI/μL) para el código NIBSC 10/266. En la Figura 5 se muestran las curvas de amplificación para el objetivo de VHB de los 5 patrones de VHB del kit y una curva estándar representativa para el mismo. La pendiente de la curva estándar es -3,361, R2 es 0,99996 y la eficiencia es 0,98. En la Figura 6 se muestran las curvas de amplificación para el objetivo de CI de los 5 patrones del VHB.
Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo para detectar y cuantificar el ADN del VHB a partir de muestras de plasma/suero humano. Extraer ADN viral de una muestra de suero/plasma humano de un individuo sospechoso de VHB. Prepare la mezcla de PCR añadiendo cada componente de PCR excepto el ADN/estándar(es) de la plantilla. Dispensarlo en tubos/pocillos de PCR. Agregue el ADN/patrones virales extraídos como ADN plantilla y cierre los tubos de PCR. Cárguelo en una máquina de PCR en tiempo real, inicie la ejecución de PCR y analice el resultado una vez finalizada la ejecución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Gráfico de amplificación del Estándar 2 (utilizado como PC) y NTC. Aquí se muestra un gráfico de amplificación del estándar 2 del VHB para los objetivos del VHB y del CI. Para el análisis cualitativo de resultados, se puede utilizar el Estándar 2 como control positivo. En el caso de NTC, no se observó amplificación para ninguna de las dianas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gráficos de amplificación para una muestra positiva para el VHB, una muestra negativa para el VHB y una muestra con inhibición por PCR. Aquí se muestran gráficos de amplificación para tres muestras diferentes: VHB positivo (Caso 1), VHB negativo (Caso 2) y una muestra que contiene inhibidores de PCR (Caso 3). En el caso de la muestra positiva para el VHB, ambas dianas se amplifican, mientras que solo se amplificó el CI para la muestra negativa para el VHB, y no se observó amplificación para la diana del VHB como se esperaba. Ni el VHB ni el CI se amplificaron para el Caso 3, lo que significa que la inhibición de la PCR se produjo debido a los inhibidores de la PCR presentes en la muestra de ADN utilizada como plantilla de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Curva de amplificación, valor de Ct para el VHB y concentración obtenida del VHB (UI/μL) para el código NIBSC 10/266. El ADN viral extraído del código NIBSC 10/266 se ejecutó junto con los 5 estándares del VHB y el NTC. La curva de amplificación para el objetivo del VHB se muestra para la muestra de código NIBSC 10/266 en el panel superior. Su valor de Ct para el VHB es de 18,94 y la concentración calculada es de 6659 UI/μL, que se muestra en el panel inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Curvas de amplificación para el objetivo del VHB de los 5 estándares del VHB y la curva estándar. Las curvas de amplificación para el objetivo del VHB (canal verde) de los 5 patrones del VHB se muestran en el panel superior. En el panel inferior se muestra una curva estándar junto con su pendiente (3,361), el valor de R2 (0,99996) y la eficiencia de PCR (0,98). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Curvas de amplificación para el objetivo de CI de los 5 estándares de VHB. Aquí se muestran las curvas de amplificación de 5 patrones de VHB para el CI (canal amarillo). Como era de esperar, tienen el mismo aspecto con valores de Ct similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Las curvas de amplificación para el objetivo del VHB de los 5 estándares del VHB y el NTC se ejecutaron por triplicado. Los gráficos de amplificación de tres réplicas para la diana del VHB (canal verde) de los 5 estándares del VHB muestran resultados similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Curvas de amplificación para la diana del VHB del código NIBSC 10/266, el código NIBSC 14/198 y sus cinco diluciones. Aquí se muestran las curvas de amplificación para la diana del VHB (canal verde) de las muestras de referencia Código NIBSC 10/266, código NIBSC 14/198 y sus cinco diluciones (1,25 UI/ml, 2,5 UI/ml, 5 UI/ml, 25 UI/ml y 50 UI/ml). No se detectó amplificación para 1,25 UI/mL, mientras que otras diluciones mostraron curvas de amplificación adecuadas antes de 38 Ct. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Descripción |
| Mezcla maestra multiplexada | Tampón de PCR, ADN polimerasa Taq de arranque en caliente y otros componentes de PCR |
| Mezcla de sonda de cebado HBV | Cebadores y mezcla de sondas para la detección del VHB |
| Mezcla endógena de sonda de cebador IC | Cebadores y mezcla de sondas para la detección de control interno (CI) endógeno |
| Normas para el VHB | · Estándar 1 de VHB |
| · Estándar 2 de VHB | |
| · Estándar 3 de VHB | |
| · Estándar 4 de VHB | |
| · Estándar 5 de VHB | |
| Control negativo | Agua libre de nucleasas de grado PCR |
Tabla 1: Reactivos suministrados con el kit de PCR en tiempo real y su descripción
| Reactivo | Volumen por reacción |
| Mezcla maestra multiplexada | 11 μL |
| Mezcla de sonda de cebado HBV | 2 μL |
| Mezcla endógena de sonda de cebador IC | 2 μL |
| Volumen total de reacción | 15 μL |
Tabla 2: Volumen de cada reactivo que debe añadirse por reacción para la preparación de la mezcla de PCR
| Paso | Temperatura (°С) | Hora | Recogida de datos | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 94 | 10 minutos | - | 1 |
| Ciclos de PCR | 94 | 15 s | - | 40 |
| 55 | 60 s | En | ||
| 72 | 15 s | - |
Tabla 3: Condiciones de los ciclos de PCR
| Blanco | Rotor-Gene Q* | CFX 96 | PCR en tiempo real de ABI# |
| VHB | Verde | FAM | FAM |
| IC | Amarillo | MALEFICIO | VIC |
| *Configuración de optimización de ganancia automática: seleccione 'Realizar optimización antes de la 1ª adquisición' | |||
| #Solo para las máquinas de PCR en tiempo real de Applied Biosystems, seleccione ROX como el tinte de "Referencia pasiva" durante la configuración de la placa, ya que la mezcla maestra del kit contiene ROX | |||
Tabla 4: Selección de colorantes para diferentes plataformas de PCR en tiempo real
| Instrumento de PCR en tiempo real | Tintes | Rango de valores de umbral§ |
| PCR en tiempo real de ABI¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| MALEFICIO | 50–400 | |
| Rotor-Gene Q | Verde | 0.015–0.03 |
| Amarillo | 0.01–0.02 | |
| §Un valor umbral absoluto varía de un instrumento a otro dependiendo de la antigüedad del instrumento, el modelo y el estado de calibración | ||
| ¶Estos valores de umbral son aplicables cuando se selecciona ROX como el tinte de 'Referencia pasiva' | ||
| †La fluorescencia relativa aumenta de 2 a 5 veces cuando se utilizan los tubos de PCR blancos de Bio-Rad en lugar de los tubos transparentes. Por lo tanto, el valor umbral debe determinarse en consecuencia | ||
Tabla 5: Valores umbral recomendados para diferentes plataformas de PCR en tiempo real
| Tipo de muestra | Caso | Señal de amplificación en | Interpretación de los resultados | |||
| FAM/Verde | HEX/VIC/Amarillo | |||||
| Control | Estándar 2/PC | Sí (20 ± 2) | Sí (24 ± 3) | Estándar 2/PC funciona correctamente | ||
| NTC | No | No | NTC está funcionando correctamente | |||
| Muestra | 1 | Sí | Sí / No* | Detección de ADN específico del VHB | ||
| 2 | No | Sí | No se detectó ADN específico del VHB. La muestra no contiene una cantidad detectable de ADN específico del VHB | |||
| 3 | No | No | Posible inhibición de la PCR, diluir la muestra de ADN (1:10) / volver a extraer el ADN de la muestra original y repetir la PCR | |||
| *La detección del control interno no es necesaria cuando se detecta el objetivo del VHB. Una alta carga de ADN del VHB en la muestra puede conducir a la reducción o ausencia de la señal de control interno | ||||||
Tabla 6: Interpretación de los resultados de los inhibidores positivos, negativos y de PCR que contienen muestras de mala calidad
| Estándar | Concentración (UI/μl) | Ct deseado | |
| VHB | IC | ||
| (FAM/ Verde) | (HEX/VIC/Amarillo) | ||
| Estándar 1 de VHB | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| Estándar 2 de VHB | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| Estándar 3 de VHB | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| Estándar 4 de VHB | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| Estándar 5 de VHB | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Cuadro 7: Estándares del VHB y su concentración del objetivo del VHB y los valores deseados de Ct
| Muestra | Ct esperado | Obtención de Ct para el VHB | Ct promedio | Desviación estándar | CV % | ||
| Replicar 1 | Replicar 2 | Replicar 3 | |||||
| Estándar 1 de VHB | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| Estándar 2 de VHB | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| Estándar 3 de VHB | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| Estándar 4 de VHB | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| Estándar 5 de VHB | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabla 8: Valores de Ct, promedio, desviación estándar y coeficiente de variación (CV%) obtenidos de 5 estándares de VHB.
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Discussion
Al código NIBSC 10/266 se le ha asignado una unidad de 9,55.000 UI/mL cuando se reconstituye en 0,5 mL de agua libre de nucleasa, según la información del proveedor21. Esto puede considerarse una muestra positiva para el VHB de alta carga. La carga viral del VHB determinada por el kit de carga viral utilizado en este estudio fue de 6,65,900 UI/mL (Figura 4). Como la eficiencia de extracción de ADN de cualquier kit de extracción de ADN no es del 100%, a menudo se pierde parte del ADN durante el proceso de purificación. Aunque la carga viral determinada por el kit es ligeramente inferior al valor asignado por el proveedor del reactivo (código NIBSC 10/266), los datos siguen siendo satisfactorios, ya que la diferencia log10 entre los dos valores es de solo 0,157, que es menor que el valor de corte (0,5)22.
El kit de carga viral utilizado en este protocolo es muy robusto y proporciona datos reproducibles, como se muestra en la Figura 7. En este experimento, los 5 patrones y NTC se ejecutaron por triplicado, y sus valores de Ct, promedio, desviación estándar y coeficiente de variación (CV%) se muestran en la Tabla 8. Un CV% inferior al 1%, como se menciona en la Tabla 8, indica que el experimento es más fiable y produce resultados muy precisos.
Se utilizó una muestra de referencia de carga muy baja (código NIBSC: 14/198)23 con el kit para comprobar su LoD. El código NIBSC 14/198 contiene menos de 50 UI/ml de ADN del VHB según la información del proveedor. Se extrajo ADN del código NIBSC 14/198 y se prepararon múltiples diluciones (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL y 25 UI/mL) del ADN. El kit utilizó todas las diluciones y 5 patrones de VHB como patrón de ADN. Se observó que ese kit puede detectar todas las diluciones de hasta 2,5 UI/mL de ADN del VHB (Figura 8), y coincide exactamente con el LoD del kit de carga viral. Por lo tanto, el kit de carga viral es una herramienta altamente sensible y reproducible que los laboratorios de diagnóstico molecular pueden utilizar para ayudar a los profesionales de la salud a diagnosticar y manejar las infecciones por VHB de manera efectiva.
Los usuarios deben tener en cuenta los siguientes pasos críticos al realizar el procedimiento. Los usuarios deben emplear solo ADN extraído de alta calidad como plantilla de PCR para garantizar resultados precisos. Es importante evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación (no más de 3 veces) de los reactivos. La mezcla de PCR no debe exponerse a la luz durante mucho tiempo, ya que contiene la sonda fluorescente sensible a la luz y el colorante de referencia pasivo ROX. Es fundamental no incluir siempre ningún control de plantilla ni estándares en cada ejecución para garantizar la precisión y fiabilidad de los resultados. Siempre se deben utilizar pipetas calibradas con puntas filtradas estériles. El ADN molde y los patrones deben añadirse en un área separada con una pipeta diferente de la zona de preparación de la reacción para evitar la contaminación cruzada.
A continuación se presentan algunos consejos comunes para la solución de problemas para la detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en PCR en tiempo real. La señal de amplificación en el control negativo puede ocurrir debido a la contaminación cruzada durante la configuración de la reacción. Por lo tanto, el usuario debe verificar si hay contaminación de los componentes del kit. Es posible que no se produzca ninguna señal de amplificación con patrones debido a las siguientes razones: (i) Se utiliza una mezcla de PCR incorrecta. El usuario debe comprobar si todos los componentes se han añadido correctamente o no. (ii) Uso de reactivos caducados. El usuario debe comprobar la fecha de caducidad antes de configurar la reacción. (iii) Almacenamiento inadecuado de reactivos. Asegúrese de que los reactivos se almacenen a -20 °C o menos y que no se mantengan a temperatura ambiente durante mucho tiempo durante la configuración de la reacción. (iv) Se utilizó una condición de ciclo de PCR incorrecta. En tal caso, se recomienda repetir la PCR con el programa correcto. (iv) Puede producirse una señal débil o nula del control interno de las muestras debido a la alta carga del VHB en la muestra y a la inhibición de la PCR. El usuario podría diluir la muestra de ADN (1:10) y repetir el ensayo para detectar una alta carga de VHB en la muestra. En el caso de la inhibición por PCR, el ADN de la muestra debe volver a extraerse con reactivos de buena calidad y se debe repetir el ensayo.
La detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en PCR en tiempo real es una técnica muy sensible y específica, pero tiene algunas limitaciones, como el coste y la complejidad. Los instrumentos y reactivos de PCR en tiempo real pueden ser costosos, y el costo de las pruebas puede ser una barrera para algunos pacientes y sistemas de atención médica. La PCR en tiempo real es una técnica compleja que requiere personal capacitado para realizar el ensayo e interpretar los resultados. Es una medida indirecta de la carga viral, por lo que tanto la calidad de los patrones como el ADN plantilla pueden influir en el resultado. El nuevo genotipo del VHB y/o la(s) mutación(es) en la región cebador-sonda puede dar lugar a resultados falsos negativos.
La detección y cuantificación del ADN del VHB basada en PCR en tiempo real es un método altamente sensible y específico que puede detectar niveles bajos de ADN viral. En comparación con otros métodos, como las pruebas serológicas (ELISA y ensayo de flujo lateral), la PCR en tiempo real tiene varias ventajas. En primer lugar, es más sensible que las pruebas serológicas. En segundo lugar, puede cuantificar la cantidad de ADN del VHB presente en una muestra, mientras que las pruebas serológicas solo pueden proporcionar un resultado cualitativo. Por último, la PCR en tiempo real es menos propensa a falsos positivos que las pruebas serológicas24. En general, la PCR en tiempo real es el método más sensible, específico y cuantitativo disponible para la detección y cuantificación del ADN del VHB. También es una técnica relativamente rápida, lo que la hace ideal para uso clínico.
La detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en PCR en tiempo real es una herramienta poderosa con varias aplicaciones futuras, incluido el desarrollo de nuevas terapias antivirales y pruebas en el punto de atención. La técnica se puede utilizar para detectar nuevos medicamentos antivirales y para monitorear la eficacia de estos medicamentos en ensayos clínicos. Esto podría conducir al desarrollo de tratamientos más eficaces y menos tóxicos para la infección por VHB. Los instrumentos de PCR en tiempo real son cada vez más pequeños y portátiles, lo que permite realizar pruebas de carga viral del VHB en el punto de atención. Esto podría mejorar el acceso a las pruebas y conducir a un diagnóstico y tratamiento más tempranos de la infección por VHB. Los regentes de este kit basado en PCR en tiempo real se pueden adaptar con PCR digital para una cuantificación absoluta para un control más preciso de la carga del vial.
Además de estas aplicaciones específicas, es probable que la detección y cuantificación del ADN del VHB basada en PCR en tiempo real desempeñe un papel importante en la investigación y el desarrollo de nuevas herramientas y estrategias para prevenir, diagnosticar y tratar la infección por el VHB.
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Disclosures
Los autores están asociados con Kilpest India Limited, el fabricante del kit de carga viral del VHB utilizado en este estudio.
Acknowledgments
Agradecemos a Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita y Shikha por su asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
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