CApillary FEeder (CAFE) Assay: שיטה למעקב אחר צריכת מזון והעדפה בדרוסופילה

Overview

סרטון זה מתאר את CApillary FEeder, או CAFE, assay, שיטה התנהגותית המודדת צריכת מזון והעדפה של זבובי פירות בלתי מרוסנים. הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לבצע את ההסתעפות עם אידוי מינימלי של נימים מלאים בנוזל המשמשים לאספקת המזון ולעקוב אחר צריכתו.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Diegelmann ואח ', CApillary FEeder Assay מודד את צריכת המזון ב Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. הרכבה וביצוע של מבחני FEeder CApillary

1. אם אין צורך בצום, העבר את זבובי הניסוי לתחת על ידי הקשה או על ידי מציצה. הקפד לכלול שלושה בקבוקוני בקרה ללא זבובים לכמת אידוי.
2. הסר בזהירות קצה פיפטה (2 - 20 μL נפח) כי הוא סוגר את אחד הפתחים החיצוניים, ולהכניס נימי זכוכית מלא, הקצה התחתון הראשון. לאבטח את נימי על ידי הצבת קצה פיפטה בחזרה ליד נימי. אם נבדקים מספר פתרונות מזון, חזור על הליך זה בהתאם.
3. מניחים את הקצוות נימי בתוך כל הבקבוקונים באותה רמה, כדי למנוע הטיה שעלולה להתרחש אם מקורות המזון היו ממוקמים בגבהים שונים (3 - 4 ס"מ מהמכסה); שמור מרחק לנייר הסינון כדי למנוע את נימי דולף בטעות על ידי נגיעה בטעות נייר המסנן או צמיגות שונות של מקורות מזון.
4. תווית הקצה העליון של הנוזל הצבעוני באמצעות עט סמן (סימון_התחלה). כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות את הנימים השונים, סמן אותם בנפרד באמצעות קוד צבע או פס.
5. הנח מבחני CAFE מוכנים מרובים בתוך קופסת פלסטיק עם שיבוץ מרושת והעבר את התיבה(איור 2A)למיקום מאובטח בתנאי מעבדה או בתא אקלים מבוקר טמפרטורה, אור ולחות (פרמטרים: 25 °C (60 מעלות צלזיוס, 60% לחות יחסית, 12 שעות / 12 שעות מחזור כהה בהיר) לתקופת הניסוי(למשל 3 שעות או ימים).
6. כמו נייר מסנן התחתון מתייבש אם התסעפות מבוצעת על פני כמה ימים, להחיל מים מתוקים כל 24 שעות דרך באנג ספוג (100 μL) כדי לשמור על לחות קבוע בתוך ההסכמה. השתמשו בארבעה בקבוקונים נפרדים (גובה 8 ס"מ, קוטר 3.3 ס"מ) במילוי 30 מ"ל ddH₂O כמכשירי לחות והניחו אותם ליד מבחני CAFE בקופסת הפלסטיק. השתמשו בכיסוי לקופסת הפלסטיק ליצירת סביבה מבוקרת לחות במהלך הניסוי (איור 2A).
   שים לב: שונות רחבה יותר מתרחשת בתנאי מעבדה; עם זאת, ניתן לבצע את בדיקת CAFE בטמפרטורת החדר(למשל,בכיתה). מומלץ מאוד להשתמש במכשיר לחות (נייר סינון, עם או בלי באנג ספוג רטוב, בקבוקוני מים מלאים וכיסוי לקופסת הפלסטיק) כדי להפחית את האידוי (איור 2B).
7. החליפו את הנימים עם נימים טריים לניסויים ארוכי טווח כל 24 שעות. שימו לב לזבובים מתים לפני כל מרווח זמן של 24 שעות והשתמשו במספר הזבובים החיים כדי לחשב את הצריכה לכל זבוב לתקופה הבאה. השלך את נימי הישן לאחר מדידת הירידה של המניסקוס (ראה 2.1).
   שים לב: במהלך ניסוי של 3 שעות אנחנו בקושי רואים זבובים מתים. במהלך מחקר של 4 ימים אנו מוצאים בדרך כלל 1 - 3 זבובים מתים.
8. בסוף ההסמכה או לפני החלפת נימי, לסמן את המניסקוס התחתון של נימי_{(סימן סוף)}עם עט סמן בעוד ASSay CAFE הוא עדיין במצב זקוף. מחק את הנתונים אם_סיום הסימון אינו נמוך מהסימון ההתחלתי (סמן_התחלה). אל תסיר את המכסה, שכן זה עשוי לשנות את המניסקוס.
9. הסר בזהירות את הנימים מהמסירה ואחסן אותם לאיסוף נתונים. בדוק אם הנוזל בתוך נימי הגיע לקצה התחתון אם לא להשליך את הנתונים, כמו מזון לא היה נגיש זבובים. לאסוף את כל נימים לכל בקבוקון כקבוצה. הכנס טיפים פיפטה נימולים לכל הפתחים כדי למנוע זבובים לברוח. מפרקים את ההתקנה ושוטפים את הבקבוקונים, העפעפיים ודרגשי הספוג באמבט סבון ומתייבשים למשך הלילה בטמפרטורת החדר לשימוש נוסף.
   שים לב: זבובים יכולים להיות מנותחים עוד יותר לאחר ההסתעפות. אשר ספיגת מזון על ידי העין או תחת מיקרוסקופ ניתוח.
10. חזור על ניסויים עם אותם גנוטיפים בשלושה ימים שונים לפחות.

2. איסוף וניתוח נתונים

1. מדוד את המרחק בין סימון_התחלה וסימון_קצה על נימי באמצעות קליפר או סרגל. כדי להעביר נתונים ישירות לגיליון אלקטרוני, השתמש בקאליפר דיגיטלי המחובר באמצעות USB (אפיק טורי אוניברסלי) (איור 1E). השלך את הנימים לאחר המדידה.
2. חשבון עבור גודל נימי כדי לחשב ספיגת מזון או אידוי. לדוגמה, שקול נימי כי הוא 73 מ"מ ארוך ומכיל 5 μL של פתרון מזון. ירידה של 14.6 מ"מ במיניסקוס משקפת את ספיגת 1 μL פתרון. חשב ספיגת מזון באמצעות הנוסחה הבאה:
   ספיגת מזון (μL) = מרחק נמדד (מ"מ)/ 14.6 מ"מ
3. כדי לא לכלול את ההשפעה של אידוי על צריכת המזון, לחשב אידוי ממוצע בשלושה (לכל הפחות) בקבוקונים שליטה ללא זבובים. הפחת ערך ממוצע זה מהערך המתקבל לצריכת מזון על ידי הזבובים.
4. השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע את הצריכה הכוללת לכל זבוב:
   צריכת מזון (μL) = (ספיגת מזון [μL] - אובדן אידוי [μL])/המספר הכולל של זבובים בבקבוקון. עבור ניסויים ארוכי טווח להשתמש במספר הזבובים בחיים לפני תחילת מרווח של 24 שעות.
5. כדי להסביר את ההבדלים בגודל הגוף, כגון בין זבובים זכר ונקבה, לנרמל את צריכת המזון למשקל הגוף (מזון μL / זבוב מ"ג).
6. השתמש בתוכנה סטטיסטית לניתוח נתונים. עבור נתונים המופצים בדרך כלל, השתמש במבחני Tשל התלמיד כדי לקבוע הבדלים בין שתי קבוצות זבובים והשתמש ב- ANOVA (ניתוח שונות) עם בדיקות Tukey Cramer שלאחר הוק עבור יותר משתי קבוצות. במצב בחירה, לנתח הבדלים מבחירה אקראית באמצעות בדיקת סימן מדגם אחד לא פרמטרי.

Representative Results

איור 1: דרוזופילה מלנוגאסטר צ'פרי פדר אסאי. א) מבחני ההאכלה בזבובים. נייר סינון לח מספק מים בתחתית הבקבוקון. ארבעה נימים מסופקים במהלך הניסוי (מזון בצבע אדום וכחול בנימים מנוגדים). שים לב כי נימים מאובטחים בעמדה על ידי קצה פיפטה שני, ומיקומים שאינם בשימוש סגורים באמצעות טיפים פיפטה. תקע קצף במרכז המכסה מאפשר חילופי אוויר. ב) תצוגה מפורטת של המכסה. טיפים פיפטה לחתוך (2 - 20 μL, גבולות אדומים) מוכנסים לתוך פתחים חרוטים של עמדות שאינן בשימוש, קצה פיפטה השני מוכנס לתוך קצה לחתוך כדי לסגור את החור. טיפים פיפטה לחתוך משמשים כדי לשלוט במיקום של microcapillaries, וטיפים נימולים משמשים להחזיק את נימים חזק. ג) זבוב D. melanogaster ניזון נימי. D) לאחר האכלה, צבע המזון נראה בבירור בבטן הזבוב. ה) קליפר דיגיטלי משמש למדידת המרחק בין_התחלה סימן_{וסימון סוף} המניסקוס. הנתונים מועברים ישירות לגיליון אלקטרוני של Excel באמצעות USB. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעת האידוי ב-Assay מאכיל נימי. A) מספר מבחני CAFE ממוקמים בתוך קופסת פלסטיק עם שיבוץ מרושת. לשליטה בלחות במהלך הניסוי ארבעה בקבוקונים מלאים במים (חישוקים אדומים) ממוקמים בתוך הרשת. פקדי האידוי ממוקמים בסמיכות ישירה לבקבוקונים אלה. כיסוי עבור ההתקנה כולה מוצג ברקע. ב) השוואה בין אובדן הנפח באמצעות אידוי. הערך הממוצע לאידוי במשך 4 ימים מוצג. הלחות נשלטת על ידי (i) החלת מים על באנג ספוג מרכזי (מרווח של 24 שעות); (ii) הוספת ארבעה בקבוקונים מלאים במים לרשת; ו-(iii) שימוש בכיסוי פלסטיק לכל מערך. האידוי נמוך משמעותית אם הלחות נשלטת עבור שני הפתרונות שנבדקו (***P ≤ 0.001; N = 48). אין הבדלים בתנודתיות בין EtOH המכיל פתרון סוכרוז שאינו מכיל ניתן לזהות עם התקני לחות בשימוש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL