Intrathoracale injectie: samengestelde levering aan het volwassen zebravishart

Overview

Deze video beschrijft de techniek van het leveren van verbindingen in het hart van volwassen zebravissen met behulp van intrathoracale injectie.

Protocol

1. Bereiding van de vis voor intrathoracale injectie

1. Vang een volwassen zebravis (Danio rerio) met een net en breng deze over in de verdovingsoplossing.
2. Na 1−2 min, wanneer vissen stoppen met zwemmen en de beweging van operculum wordt verminderd, raak de vis aan met een plastic lepel om ervoor te zorgen dat deze niet reageert op contact.
3. Breng de vis snel en voorzichtig met de lepel over in de groef van de natte spons, met de ventrale kant naar boven. Het hoofd van de vis moet weg wijzen van de dominante hand van de operator.

2. Micro-injection in het Pericardium

1. Observeer onder de stereomicroscoop zorgvuldig de beweging van het kloppende hart onder de huid van de vis. Bepaal visueel het injectiepunt boven het kloppende hart en in het midden van de driehoek gedefinieerd door de ventrale kraakbeenplaten (figuur 1D). Plaats de punt van het capillair onder een hoek van 30−45° ten opzichte van de lichaamsas (figuur 1E). Penetreer voorzichtig de huid met de punt van het microcapillair in het hartzakje (figuur 1C). Een optimaal ingangspunt is dichter bij de buik dan bij het hoofd.
   OPMERKING: Steek het capillair niet te diep in het lichaam en het hart, omdat dit letsel aan het orgaan kan veroorzaken. In het geval van een hartpunctie vult de naald zich over het algemeen met bloed. Als dit gebeurt, verwijdert u het capillair en sluit u de vis uit van het experiment.
2. Zodra de naald zich in het pericard bevindt, voltooit u de injectie door op het pedaal van het micro-injectieapparaat te drukken.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen lucht in de borstholte injecteert.
3. Trek na injectie het capillair voorzichtig uit de thorax en breng de vis onmiddellijk over in een tank met systeemwater voor herstel.
4. Controleer de vis tot volledig herstel van anesthesie.
5. Verzamel het hart op het gewenste tijdstip en bereid het voor op verdere analyse.
   OPMERKING: In het geval dat de vis de beweging van het operculum niet binnen 30 s hervat, reanimeer de vis door water in de kieuwen te knijpen met een plastic pipet.

Representative Results

Figuur 1: Intrathoracale (IT) injectie bij volwassen zebravissen. (A) Foto van een getrokken micro-injection capillair met filament (6", 1,0 mm in diameter) en waarden van het gebruikte naaldtrekkerprogramma. (B) Foto van een getrokken micro-injection capillair met filament (6", 1,0 mm in diameter) gevuld met 2,5 μL oplossing met 10% fenolrood. De getrokken punt van de naald is maximaal 7 mm lang. (C) Schematische weergave van de IT-injectieprocedure. D) Foto's van de IT-injectieprocedure. Dit cijfer is gewijzigd van Bise et al. De nummers in panelen C en D komen overeen met dezelfde stappen van de procedure: (1) vissen worden ventrale kant omhoog geplaatst op een bevochtigde spons. De punctieplaats (rode stip in de driehoek) bevindt zich in het midden van de borst bij de kieuwen. (2) Penetratie van de naald in het hartzakje. Rode stip geeft de punctieplaats aan. (3) De injectie wordt gecontroleerd door de verspreiding van de rode oplossing in de hartholte te observeren. (E) Schema van IT-injectie. De hoek tussen het injectiecapillair en de lichaamsas moet tussen 30° en 45° zijn om hartpunctie te voorkomen. F) Foto's van vis thorax na 1 uur na IT-injectie van aangegeven volumes. Witte pijlen wijzen naar het roodachtige weefsel, wat kan wijzen op inwendige bloedingen

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Macroscope (binocular)	M400		with Apozoom
Micro-injector femtojet	Eppendorf	5247 0034 77
Microloaders femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette glass needles type C	WPI	TW100F-6	thin-wall capillary
Micropipette puller model P-87	Flaming/Brown	20081016	filament box 2.5 mm x 4.5 mm
Sponge	any	any	dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521