Intrathorakale Injektion: Zusammengesetzte Lieferung an das erwachsene Zebrafischherz

Overview

Dieses Video beschreibt die Technik der Lieferung von Verbindungen in das Herz von erwachsenen Zebrafischen durch intrathorakale Injektion.

Protocol

1. Zubereitung des Fisches zur intrathorakalen Injektion

1. Fangen Sie einen erwachsenen Zebrafisch (Danio rerio) mit einem Netz und übertragen Sie ihn in die Anästhetikumlösung.
2. Nach 1 bis 2 min, wenn der Fisch aufhört zu schwimmen und die Bewegung von Operculum reduziert wird, berühren Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel, um sicherzustellen, dass er nicht auf irgendeinen Kontakt reagiert.
3. Den Fisch mit dem Löffel schnell und vorsichtig in die Nut des nassen Schwamms geben, mit ventraler Seite nach oben. Der Kopf des Fisches sollte von der dominanten Hand des Bedieners wegzeigen.

2. Mikroinjektion in das Perikard

1. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop sorgfältig die Bewegung des schlagenden Herzens unter der Haut der Fische. Bestimmen Sie visuell den Injektionspunkt über dem schlagenden Herzen und in der Mitte des Dreiecks, das durch die ventralen Knorpelplatten definiert wird (Abbildung 1D). Setzen Sie die Spitze der Kapillare in einem Winkel von 30 bis 45° relativ zur Körperachse ein (Abbildung 1E). Durchdringen Sie die Haut vorsichtig mit der Spitze der Mikrokapillare in das Perikard (Abbildung 1C). Ein optimaler Einstiegspunkt ist näher am Bauch als am Kopf.
   HINWEIS: Setzen Sie die Kapillare nicht zu tief in den Körper und das Herz ein, da dies zu Verletzungen des Organs führt. Bei Herzpunktion füllt sich die Nadel in der Regel mit Blut. Entfernen Sie in diesem Fall die Kapillare und schließen Sie die Fische aus dem Experiment aus.
2. Sobald sich die Nadel im Perikard befindet, vollständige Injektion durch Drücken des Pedals der Mikroinjektorvorrichtung.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Luft in die Brusthöhle zu injizieren.
3. Nach der Injektion die Kapillare vorsichtig aus dem Thorax ziehen und den Fisch sofort in einen Tank mit Systemwasser zur Rückgewinnung geben.
4. Überwachen Sie die Fische bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie.
5. Sammeln Sie das Herz zum gewünschten Zeitpunkt und bereiten Sie es für die weitere Analyse vor.
   HINWEIS: Falls der Fisch die Bewegung des Operculums nicht innerhalb von 30 s wieder aufnimmt, reanimieren Sie den Fisch, indem er Wasser mit einer Kunststoffpipette in die Kiemen drückt.

Representative Results

Abbildung 1: Intrathorakale (IT) Injektion bei erwachsenen Zebrafischen. (A) Foto einer gezogenen Mikroinjektionskapillare mit Filament (6", 1,0 mm Durchmesser) und Werten des verwendeten Nadelzieherprogramms. (B) Foto einer gezogenen Mikroinjektionskapillare mit Filament (6", 1,0 mm Durchmesser), gefüllt mit einer Lösung von 2,5 l, die 10 % Phenolrot enthält. Die gezogene Spitze der Nadel ist maximal 7 mm lang. (C) Schematische Darstellung des IT-Injektionsverfahrens. (D) Fotos des IT-Injektionsverfahrens. Diese Zahl wurde von Bise et al. geändert. Die Zahlen in den Paneelen C und D entsprechen den gleichen Schritten des Verfahrens: (1) Fische werden ventral auf einen befeuchteten Schwamm gelegt. Die Punktionsstelle (roter Punkt im Dreieck) befindet sich in der Mitte der Brust in der Nähe der Kiemen. (2) Eindringen der Nadel in das Perikard. Roter Punkt zeigt Punktionsstelle an. (3) Die Injektion wird überwacht, indem die Ausbreitung der roten Lösung in der Perikardhöhle beobachtet wird. (E) Schema der IT-Injektion. Der Winkel zwischen der Injektionskapillare und der Körperachse sollte zwischen 30° und 45° liegen, um eine Kernpunktung des Herzens zu vermeiden. (F) Fotos von Fischthorax nach 1 Stunde nach DER IT-Injektion der angegebenen Mengen. Weiße Pfeile zeigen auf das rötliche Gewebe, was auf innere Blutungen hindeuten könnte

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Macroscope (binocular)	M400		with Apozoom
Micro-injector femtojet	Eppendorf	5247 0034 77
Microloaders femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette glass needles type C	WPI	TW100F-6	thin-wall capillary
Micropipette puller model P-87	Flaming/Brown	20081016	filament box 2.5 mm x 4.5 mm
Sponge	any	any	dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521