Overview
Denna video beskriver tekniken att leverera föreningar i hjärtat av vuxna zebrafisk genom att använda intrathoracic injektion.
Protocol
1. Beredning av fisken för intrathoracic injektion
- Fånga en vuxen zebrafisk (Danio rerio) med ett nät och överför den till bedövningslösningen.
- Efter 1−2 min, när fisken slutar simma och rörelse av operculum reduceras, rör fisken med en plastsked för att se till att den inte reagerar på någon kontakt.
- Överför snabbt och försiktigt fisken med skeden i spåret av den våta svampen, med ventral sida upp. Fiskens huvud bör peka bort från operatörens dominerande hand.
2. Mikroinjektion i perikardiet
- Under stereomikroskopet, observera försiktigt rörelsen hos det bultande hjärtat under fiskens hud. Visuellt bestämma injektionspunkten ovanför det bultande hjärtat och i mitten av triangeln som definieras av ventrala broskplattor (figur 1D). För in kapillärspetsen i 30−45° graders vinkel i förhållande till kroppsaxeln (bild 1E). Penetrera försiktigt huden med mikrokapillärens spets i perikardiet (figur 1C). En optimal ingångspunkt är närmare buken än huvudet.
OBS: Sätt inte in kapillären för djupt in i kroppen och hjärtat, eftersom detta kommer att orsaka skada på organet. Vid hjärtpunktion fylls nålen i allmänhet med blod. Om detta händer, ta bort kapillären och uteslut fisken från experimentet. - När nålen är inne i perikardiet, slutför injektionen genom att trycka på pedalen på mikroinjektorenheten.
OBS: Var försiktig så att du inte injicerar luft i brösthålan. - Efter injektionen, dra försiktigt kapillären från bröstkorgen och överför omedelbart fisken till en tank med systemvatten för återhämtning.
- Övervaka fisken tills den totala återhämtningen från anestesi.
- Samla hjärtat vid önskad tidpunkt och förbered det för vidare analys.
OBS: Om fisken inte återupptar rörelse av operculum inom 30 s, återuppliva fisken genom att klämma vatten i gälarna med en plastpipett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Intrathoracic (IT) injektion i vuxna zebrafiskar. a) Fotografi av ett draget mikroinjektions kapillär med glödtråd (6", 1,0 mm i diameter) och värden för det nåldragsprogram som används. B) Fotografi av en dragen mikroinjektions kapillär med glödtråd (6", 1,0 mm i diameter) fylld med 2,5 μL lösning som innehåller 10 % fenolrött. Nålens dragspets är maximalt 7 mm lång. C) Schematisk representation av IT-injektionsförfarandet. D) Fotografier av IT-injektionsförfarandet. Denna siffra har ändrats från Bise et al. Nummer i panelerna C och D motsvarar samma steg i proceduren: (1) fisk placeras ventral sida upp på en fuktad svamp. Punkteringsstället (röd prick i triangeln) ligger i mitten av bröstet nära gälarna. (2) Nålpensration i perikardiet. Röd punkt indikerar punkteringsställe. (3) Injektionen övervakas genom att observera spridningen av den röda lösningen i perikardvätskan. e) System för IT-injektion. Vinkeln mellan injektions kapillären och kroppsaxeln bör vara mellan 30° och 45° för att undvika hjärtpunktion. F) Fotografier av fiskkorgen 1 timme efter IT-injektion av angivna volymer. Vita pilar pekar på den rödaktiga vävnaden, vilket kan tyda på inre blödningar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
