Overview
Bu videoda, intratorasik enjeksiyon kullanılarak yetişkin zebra balıklarının kalbine bileşiklerin teslim edilmesi tekniği açıklanmaktadır.
Protocol
1. Intratorasik Enjeksiyon için Balığın Hazırlanması
- Yetişkin bir zebra balığını(Danio rerio)bir ağ ile yakalayın ve anestezik çözeltiye aktarın.
- 1−2 dakika sonra, balık yüzmeyi bıraktığında ve operkülün hareketi azaldığında, herhangi bir temasa tepki vermediğinden emin olmak için balığa plastik bir kaşıkla dokunun.
- Kaşıkla balıkları hızlı ve dikkatli bir şekilde ventral tarafı yukarı olacak şekilde ıslak süngerin oluğuna aktarın. Balığın başı operatörün baskın elinden uzağa işaret etmelidir.
2. Perikardiyuma Mikroenjeksiyon
- Stereomikroskop altında, atan kalbin balığın derisinin altındaki hareketini dikkatlice gözlemleyin. Atan kalbin üzerindeki ve ventral kıkırdaklı plakalar tarafından tanımlanan üçgenin ortasındaki enjeksiyon noktasını görsel olarak belirleyin (Şekil 1D). Kılcal damarın ucunu gövde eksenine göre 30−45° derece açıyla yerleştirin (Şekil 1E). Mikrokapillerin ucuyla cilde perikard içine hafifçe nüfuz edin (Şekil 1C). Optimal bir giriş noktası, karın bölgesine kafaya göre daha yakındır.
NOT: Kılcal damarı vücuda ve kalbe çok derinlemesine sokmayın, çünkü bu organda yaralanmaya neden olur. Kalp delinmesi durumunda, iğne genellikle kanla dolar. Bu durumda, kılcal damarı çıkarın ve balıkları deneyden çıkarın. - İğne perikardın içine girdikten sonra mikroenjektör cihazının pedaline basarak enjeksiyonu tamamlayın.
NOT: Torasik boşluğa hava enjekte etmemeye dikkat edin. - Enjeksiyondan sonra, kılcal damarı torakstan hafifçe çekin ve balığı hemen geri kazanım için sistem suyu içeren bir tanka aktarın.
- Anesteziden tamamen iyileşene kadar balığı izleyin.
- İstediğiniz zaman noktasında kalp toplayın ve daha fazla analiz için hazırlayın.
NOT: Balığın 30 s içinde operkülün hareketine devam edemezse, suyu plastik bir pipetle solungaçlara sıkarak balığı yeniden canlandırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1: Yetişkin zebra balıklarında intratorasik (BT) enjeksiyon. (A) Filamentli (6", 1,0 mm çapında) çekilmiş bir mikroenjeksiyon kılcal damarının fotoğrafı ve kullanılan iğne çekme programının değerleri. (B) %10 fenol kırmızısı içeren 2,5 μL çözelti ile doldurulmuş filamentli (6", 1,0 mm çapında) çekilmiş bir mikroenjeksiyon kılcal damarının fotoğrafı. İğnenin çekilen ucu maksimum 7 mm uzunluğundadır. (C) BT enjeksiyon prosedürünün şematik gösterimi. (D) BT enjeksiyon prosedürünün fotoğrafları. Bu rakam Bise ve ark.'dan değiştirilmiştir. C ve D panellerindeki sayılar prosedürün aynı adımlarına karşılık gelir: (1) balıklar nemlendirilmiş bir süngerin üzerine ventral tarafa yerleştirilir. Delinme bölgesi (üçgendeki kırmızı nokta) göğsün merkezinde solungaçların yakınında bulunur. (2) İğnenin perikardiyuma nüfuz etmesi. Kırmızı nokta delinme bölgesini gösterir. (3) Enjeksiyon, kırmızı çözeltinin perikardiyal boşlukta yayılımı gözlemlenerek izlenir. (E) BT enjeksiyon şeması. Kalp delinmesi önlemek için enjeksiyon kılcal damarı ile vücut ekseni arasındaki açı 30° ile 45° arasında olmalıdır. (F) Belirtilen hacimlerin BT enjeksiyonundan 1 saat sonra balık toraksının fotoğrafları. Beyaz oklar kırmızımsı dokuyu gösteriyor, bu da iç kanamayı gösterebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
