حقن العظام: زرع خلايا سرطانية محددة الأنسجة في فأر الكبار

Overview

يوضح الفيديو تقنية التطعيم التقويمي لسرطان الثدي في نموذج الماوس. تنتج هذه التقنية معدل تكوين ورم مرتفع مع تباين أقل في حجم الورم وشكله مقارنة بالحقن تحت الجلد أو غير الجراحي.

Protocol

1. إعداد الخلايا (ل 10 الفئران)

ملاحظة: يجب تلقيح الخلايا في غضون ساعة واحدة بعد فصلها عن الطبق لتجنب انخفاض صلاحية الخلية. على وجه التحديد ، يجب خلط تعليق الخلية في خليط البروتين الجيلاتيني في غضون 15 دقيقة بعد فصل الخلايا عن الطبق للحفاظ على قدرتها على البقاء.

1. ثقافة 4T1-luc2 الخلايا، فأر مامي خط الخلية الغدي يعبر عن لوسيفيراز، في وسائل الإعلام RPMI 1640 مع 10٪ FBS في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
2. اغسل الخلايا الملتصقة 4T1-luc2 في طبق 10 سم مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين باستخدام ماصة P1000، ومن ثم، احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم، إضافة 4 مل من وسائل الإعلام النمو (RPMI-1640 مع 10٪ FBS) باستخدام ماصة المصلية 5 مل ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. الطرد المركزي تعليق الخلية في 180 × ز لمدة 5 دقائق.
3. يستنشق supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني; ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
4. تعليق 2 × 10⁶ خلايا 4T1-luc2 في 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد (درجة الحموضة 7.4، 4 درجة مئوية) في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
5. اخلط تعليق الخلية 40-μL مع 360 ميكرولتر من خليط البروتين الجيلاتيني في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل على الجليد في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
   ملاحظة: التركيز النهائي هو 1 × 10⁵/20 ميكرولتر (1:9 PBS: خليط البروتين الجيلاتيني). بالنسبة لنموذج تقويم العظام (بدون استئصال الثدي)، تم استخدام 1 × 10⁴/20 ميكرولتر من التركيز النهائي، لتجنب الوصول إلى معايير القتل الرحيم (حجم الورم > 2 سم) في غضون أسبوعين.

2. تلقيح الخلايا السرطانية

1. وضع الفئران في غرفة تحريض التخدير مع 2-4٪ isoflurane و 0.2 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين حتى الفئران تتنفس بهدوء (2-3 دقيقة).
2. فهم الماوس وحقن 0.05 ملغم/ كغ البوبرينورفين في كتفه تحت الجلد.
3. تأكد من التخدير الكافي بسبب عدم وجود رد فعل على قرصة إصبع القدم. أدخل أنف الفأر في ثقب قناع الماوس ، والذي يسمح بالتخدير الاستنشاقي مع 2-4٪ isoflurane و 2 L / min تدفق الأكسجين المرفقة بوحدة علبة الفحم.
4. كبح جماح أطراف الفأر باستخدام شريط المختبر وتعقيم جلده باستخدام الكلورهيكسيدين واليود والإيثانول بنسبة 75٪، وذلك باستخدام مسحات القطن.
5. إجراء شق الجلد 5 ملم في منتصف جدار الصدر الأمامي باستخدام مقص التشظي الدقيق العقيم، ورفع الجلد الجانب الأيمن بجانب شق وفصل الجلد من جدار الصدر باستخدام مقص، ومن ثم، عكس الجلد لفضح الحق #2 وسادة الدهون الثديية.
6. حقن بعناية 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية باستخدام حقنة الأنسولين 1 مل مع إبرة 28.5 G في وسادة الدهون تحت الرؤية المباشرة من خلال الجرح.
   ملاحظة: الإبرة تمر من خلال الجرح، وليس الجلد. الحفاظ على عقد الإبرة في لوحة الدهون لمدة 5 ق قبل سحبه، مما يتيح الوقت لخليط البروتين الجيلاتينية لترسيخ.
7. أغلق شقوق الجلد عن طريق الخياطة، باستخدام الغرز العقيمة 5-0 غير القابلة للامتصاص.
8. بعد الجراحة، أعد الحيوانات إلى قفص نظيف وراقبها حتى تتعافى وتتحرك بحرية (بعد حوالي 1-2 دقيقة). إذا كان الحيوان لا يبدو في صحة جيدة في غضون 24 ساعة من الجراحة، وإعطاء البوبرينورفين (0.2 ملغ / كغ).
9. إزالة الغرز تحت التخدير (انظر الخطوة 2.1) 7 د بعد الجراحة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation