Injeção Ortotópica: Implantando células cancerígenas específicas do tecido em um rato adulto

Overview

O vídeo demonstra a técnica de inoculação ortotópica do câncer de mama em um modelo de camundongo. Esta técnica produz uma alta taxa de tumorigênese com menor variabilidade no tamanho e forma do tumor em comparação com a injeção subcutânea ou não cirúrgica.

Protocol

1. Preparação de Células (para 10 Ratos)

NOTA: As células devem ser inoculadas dentro de 1h após serem separadas do prato para evitar a diminuição da viabilidade celular. Especificamente, a suspensão celular deve ser misturada na mistura de proteína gelatinosa dentro de 15 minutos após separar as células do prato para manter sua viabilidade.

1. Cultura 4T1-luc2, uma linha celular adenocarcinoma mamária de camundongos expressando luciferase, em mídia RPMI 1640 com 10% de FBS em uma incubadora umidificada a 37 °C em 5% DE CO₂.
2. Lave as células 4T1-luc2 aderentes em um prato de 10 cm com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 1 mL de trippsina de 0,25% usando uma pipeta P1000 e, em seguida, incubar a amostra a 37 °C por 5 min. Em seguida, adicione 4 mL de mídia de crescimento (RPMI-1640 com 10% FBS) usando uma pipeta sorológica de 5 mL e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL em uma capa de cultura tecidual. Centrifugar a suspensão da célula a 180 x g por 5 min.
3. Aspirar o supernasce e resuspensar as células em 2 mL de PBS; em seguida, conte as células usando o hemótmetro.
4. Suspenda 2 x 10⁶ células 4T1-luc2 em 40 μL de PBS frio (pH 7,4, 4 °C) na capa da cultura tecidual.
5. Misture a suspensão celular de 40-μL com 360 μL da mistura de proteína gelatinosa em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL no gelo na capa da cultura tecidual.
   NOTA: A concentração final é de 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:mistura de proteína gelatinosa). Para o modelo ortotópico (sem mastectomia), utilizou-se 1 x^{10 4}/20 μL da concentração final, para evitar atingir critérios de eutanásia (tamanho tumor > 2 cm) em duas semanas.

2. Inoculação de células cancerosas

1. Coloque os camundongos na câmara de indução da anestesia com 2-4% de isoflurane e 0,2 L/min de fluxo de oxigênio até que os ratos respirem calmamente (2-3 min).
2. Segure o mouse e injete 0,05 mg/kg buprenorfina em seu ombro subcutânea.
3. Confirme a anestesia adequada pela falta de reação a uma pitada de dedo do dedo do dedo. Insira o nariz do rato no orifício da máscara do rato, que permite anestesia inalatória com isoflurano de 2-4% e 2 L/min de fluxo de oxigênio ligado a uma unidade de recipiente de carvão.
4. Contenha os membros do camundongo usando fita de laboratório e esterilize sua pele usando clorexidina, iodo e 75% de etanol, usando cotonetes de algodão.
5. Faça uma incisão de pele de 5 mm no meio da parede do peito anterior utilizando uma tesoura de microdisseção estéril, levante a pele do lado direito ao lado da incisão e retire a pele da parede do peito usando a tesoura e, em seguida, inverta a pele para expor a almofada de gordura mamária #2 direita.
6. Injete cuidadosamente 20 μL de suspensão celular cancerosa usando uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 28,5 G na almofada de gordura sob visão direta através da ferida.
   NOTA: A agulha atravessa a ferida, não a pele. Continue segurando a agulha na almofada de gordura por 5 s antes de retirá-la, o que dá tempo para a mistura de proteína gelatinosa se solidificar.
7. Feche as incisões da pele costurando, utilizando suturas estéreis 5-0 não absorvíveis.
8. Após a cirurgia, devolva os animais a uma gaiola limpa e monitore-os até que eles se recuperem e estejam se movendo livremente (após ~1-2 min). Se um animal não parecer estar em boa saúde dentro de 24 horas de cirurgia, administre buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Remova as suturas sob anestesia (ver passo 2.1) 7 d após a cirurgia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation