Orthotopische injectie: weefselspecifieke kankercellen implanteren in een volwassen muis

Overview

De video toont de orthotopische inentingstechniek voor borstkanker in een muismodel. Deze techniek produceert een hoge tumorigenesesnelheid met minder variabiliteit in tumorgrootte en vorm in vergelijking met subcutane of niet-chirurgische injectie.

Protocol

1. Voorbereiding van cellen (voor 10 muizen)

OPMERKING: De cellen moeten binnen 1 uur na loslating van de schaal worden ingeënt om verminderde levensvatbaarheid van de cel te voorkomen. In het bijzonder moet de celsuspensie binnen 15 minuten na het losmaken van de cellen uit het gerecht in het gelatineachtige eiwitmengsel worden gemengd om hun levensvatbaarheid te behouden.

1. Kweek 4T1-luc2 cellen, een muis mammary adenocarcinoom cel lijn uitdrukken luciferase, in RPMI 1640 media met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37 °C in 5% CO₂.
2. Was de aanhechtende 4T1-luc2 cellen in een schaal van 10 cm met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe met behulp van een P1000 pipet en incubeer het monster vervolgens gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 4 ml groeimedia (RPMI-1640 met 10% FBS) toe met behulp van een serologische pipet van 5 ml en breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 ml in een weefselkweekkap. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten op 180 x g.
3. Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml PBS; tel vervolgens de cellen met behulp van de hemocytometer.
4. Schors 2 x 10⁶ 4T1-luc2 cellen in 40 μL koude PBS (pH 7,4, 4 °C) in de weefselkweekkap.
5. Meng de celsuspensie van 40-μL met 360 μL van het gelatineachtige eiwitmengsel in een microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs in de weefselkweekkap.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie is 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:gelatineachtig eiwitmengsel). Voor het orthotopische model (geen mastectomie) werd 1 x 10⁴/20 μL van de eindconcentratie gebruikt om te voorkomen dat binnen twee weken aan de euthanasiecriteria (tumorgrootte > 2 cm) werd voldaan.

2. Inenting van kankercellen

1. Plaats de muizen in de anesthesie inductiekamer met 2-4% isofluraan en 0,2 L/min zuurstofstroom totdat de muizen rustig ademen (2-3 min).
2. Pak de muis vast en injecteer 0,05 mg/kg buprenorfine subcutaan in de schouder.
3. Bevestig adequate anesthesie door het gebrek aan reactie op een teenknijp. Steek de neus van de muis in het gat van het muismasker, waardoor inhalatie-anesthesie mogelijk is met 2-4% isofluraan en 2 L/min zuurstofstroom bevestigd aan een houtskoolbuseenheid.
4. Houd de ledematen van de muis vast met behulp van laboratoriumtape en steriliseer de huid met chloorhexidine, jodium en 75% ethanol met wattenstaafjes.
5. Maak een 5 mm huidincisie in het midden van de voorste borstwand met behulp van steriele microdissectieschaar, til de rechterhuid naast de incisie op en maak de huid los van de borstwand met behulp van de schaar en keer vervolgens de huid om om de juiste #2 borstvetkussen bloot te leggen.
6. Injecteer voorzichtig 20 μL suspensie van kankercellen met behulp van een insulinespuit van 1 ml met een naald van 28,5 G in het vetkussen onder direct zicht door de wond.
   OPMERKING: De naald gaat door de wond, niet door de huid. Houd de naald 5 s in de vetkussen voordat u deze eruit trekt, waardoor het gelatineachtige eiwitmengsel kan stollen.
7. Sluit de incisies van de huid door te stikken, met steriele 5-0 niet-absorbeerbare hechtingen.
8. Breng de dieren na de operatie terug naar een schone kooi en bewaak ze totdat ze zijn hersteld en vrij bewegen (na ~ 1-2 minuten). Als een dier niet binnen 24 uur na de operatie in goede gezondheid lijkt te zijn, dient u buprenorfine (0,2 mg/kg) toe te dienen.
9. Verwijder de hechtingen onder narcose (zie stap 2.1) 7 d na de operatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation