הזרקה אורתוטופית: השתלת תאים סרטניים ספציפיים לרקמות לעכבר בוגר

Overview

הסרטון מדגים את טכניקת החיסון האורתוטופי של סרטן השד במודל עכבר. טכניקה זו מייצרת שיעור גידול גבוה עם פחות שונות בגודל ובצורה של הגידול בהשוואה להזרקה תת עורית או לא כירורגית.

Protocol

1. הכנת תאים (עבור 10 עכברים)

שים לב: התאים צריכים להיות מחוסנים בתוך 1 שעה לאחר מנותק מן המנה, כדי למנוע ירידה בכדאיות התא. באופן ספציפי, השעיית התא צריך להיות מעורבב לתוך תערובת חלבון ג'לטין בתוך 15 דקות לאחר ניתוק התאים מן המנה כדי לשמור על הכדאיות שלהם.

1. תרבות 4T1-luc2 תאים, קו תאים אדמנוקרצינומה של עכבר המבטא luciferase, במדיה RPMI 1640 עם 10% FBS באינקובטור לח ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO₂.
2. שטפו את תאי ה-4T1-luc2 החסידים בצלחת של 10 ס"מ עם תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין באמצעות פיפטה P1000 ולאחר מכן, דגירה המדגם ב 37 °C (69 °F) במשך 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 4 מ"ל של מדיה צמיחה (RPMI-1640 עם 10% FBS) באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל ולהעביר את השעיית התא צינור חרוט 15 מ"ל במכסה המנוע של תרבות הרקמה. צנטריפוגה השעיית התא ב 180 x g במשך 5 דקות.
3. לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב 2 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
4. להשעות 2 x 10⁶ 4T1-luc2 תאים 40 μL של PBS קר (pH 7.4, 4 °C (60 °F) במכסה המנוע של תרבות הרקמות.
5. מערבבים את השעיית התא 40-μL עם 360 μL של תערובת החלבון הג'לטיני בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח במכסה המנוע של תרבות הרקמות.
   שים לב: הריכוז הסופי הוא 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:תערובת חלבון ג'לטיני). עבור המודל האורתוטופי (ללא כריתת שד), 1 x 10⁴/20 μL של הריכוז הסופי שימש, כדי למנוע הגעה לקריטריונים המתת חסד (גודל הגידול > 2 ס"מ) בתוך שבועיים.

2. חיסון תאי סרטן

1. שים את העכברים בתא אינדוקציה הרדמה עם 2-4% isoflurane ו 0.2 L / min זרימת חמצן עד העכברים לנשום ברוגע (2-3 דקות).
2. לתפוס את העכבר ולהזריק 0.05 מ"ג /ק"ג buprenorphine לתוך הכתף שלה תת עורית.
3. אשר הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה לצביטת בוהן. הכנס את האף של העכבר לתוך החור של מסכת העכבר, המאפשר הרדמה בשאיפה עם 2-4% איזופלורן ו 2 L / min זרימת חמצן מחובר ליחידת מיכל פחם.
4. רסנו את איברי העכבר באמצעות סרט מעבדה ועקרו את עורו באמצעות כלורהקסידין, יוד ואתנול 75%, באמצעות ספוגיות כותנה.
5. הפוך חתך עור 5 מ"מ באמצע דופן החזה הקדמון ניצול מספריים microdissection סטרילי, להרים את העור בצד ימין ליד החתך ולנתק את העור מקיר החזה באמצעות מספריים, ולאחר מכן, להפוך את העור כדי לחשוף את הזכות #2 כרית שומן ממותה.
6. בזהירות להזריק 20 μL של השעיית תא סרטן באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28.5 G לתוך כרית השומן תחת ראייה ישירה דרך הפצע.
   שים לב: המחט עוברת דרך הפצע, לא דרך העור. ממשיכים להחזיק את המחט בכרית השומן במשך 5 שניות לפני משיכתה החוצה, מה שמאפשר זמן לתערובת החלבון הג'לטיני להתמצק.
7. סגור את חתכי העור על ידי תפירה, באמצעות תפרים סטריליים 5-0 שאינם נספגים.
8. לאחר הניתוח, להחזיר את בעלי החיים לכלוב נקי לפקח עליהם עד שהם התאוששו והם נעים בחופשיות (לאחר ~ 1-2 דקות). אם בעל חיים לא נראה במצב בריאותי טוב בתוך 24 שעות של ניתוח, לנהל buprenorphine (0.2 מ"ג / קילוגרם).
9. הסר את התפרים תחת הרדמה (ראה שלב 2.1) 7 ד לאחר הניתוח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation