Ortotopik Enjeksiyon: Dokuya Özgü Kanser Hücrelerini Yetişkin Bir Fareye Yerleştirme

Overview

Video, bir fare modelinde meme kanseri ortotopik aşılama tekniğini göstermektedir. Bu teknik deri altı veya ameliyatsız enjeksiyona göre tümör büyüklüğü ve şeklinde daha az değişkenlik ile yüksek tümörijenez oranı üretir.

Protocol

1. Hücrelerin Hazırlanması (10 Fare için)

NOT: Hücre canlılığının azalmasını önlemek için hücreler tabaktan ayrıldıktan sonra 1 saat içinde aşılanmalıdır. Özellikle, hücre süspansiyonu, canlılıklarını korumak için hücreleri tabaktan ayırırktan sonra 15 dakika içinde jelatinli protein karışımına karıştırılmalıdır.

1. Kültür 4T1-luc2 hücreleri, luciferaz ifade eden bir fare meme adenokarsinom hücre hattı, RPMI 1640 ortamlarında% 10 FBS ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO_2.
2. Yapışan 4T1-luc2 hücrelerini 10 cm'lik bir tabakta fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 mL serolojik pipet kullanarak yıkayın. Bir P1000 pipet kullanarak% 0.25 trypsin 1 mL ekleyin ve ardından, 5 dakika boyunca 37 ° C'de numuneyi kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 5 mL serolojik pipet kullanarak 4 mL büyüme ortamı (%10 FBS ile RPMI-1640) ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir doku kültürü başlığındaki 15 mL konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 180 x g'da santrifüj.
3. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 2 mL PBS'de yeniden biriktirin; ardından, hemositometreyi kullanarak hücreleri sayın.
4. Doku kültürü davlumbazında 40 μL soğuk PBS'de (pH 7.4, 4 °C) 2 x 10⁶ 4T1-luc2 hücrelerini askıya alın.
5. 40-μL hücre süspansiyonunu, jelatinli protein karışımının 360 μL'si ile doku kültürü davlumbazındaki buz üzerinde 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.
   NOT: Son konsantrasyon 1 x 10⁵/20 μL'dir (1:9 PBS:jelatinli protein karışımı). Ortotopik model için (mastektomi yok), ötanazi kriterlerine (tümör büyüklüğü > 2 cm) iki hafta içinde ulaşmamak için son konsantrasyonun 1 x 10⁴/20 μL'si kullanıldı.

2. Kanser Hücresi Aşısı

1. Fareler sakince nefes alana kadar (2-3 dk) %2-4 izofluran ve 0,2 L/dk oksijen akışı ile fareleri anestezi indüksiyon odasına koyun.
2. Fareyi kavrayın ve omzuna deri altından 0,05 mg/kg buprenorfin enjekte edin.
3. Bir parmak sıkışmasına reaksiyon eksikliği ile yeterli anesteziyi onaylayın. Farenin burnunu, %2-4 izofluran ve kömür kutusu ünitesine bağlı 2 L/dk oksijen akışı ile soluma anestezisine izin veren fare maskesinin deliğine yerleştirin.
4. Laboratuvar bandı kullanarak farenin uzuvlarını kısıtlayın ve pamuklu çubuklar kullanarak klorheksidin, iyot ve% 75 etanol kullanarak cildini sterilize edin.
5. Steril mikrodiseksiyon makası kullanarak ön göğüs duvarının ortasında 5 mm'lik bir deri kesisi yapın, kesiğin yanındaki sağ taraftaki deriyi kaldırın ve makası kullanarak cildi göğüs duvarından ayırın ve ardından sağ #2 meme yağ yastığını ortaya çıkarmak için cildi ters çevirin.
6. Yaradan doğrudan görüş altında yağ yastığına 28,5 G iğne ile 1 mL insülin şırıngası kullanarak 20 μL kanser hücresi süspansiyonunu dikkatlice enjekte edin.
   NOT: İğne yaradan geçer, deriden değil. Jelatinli protein karışımının katılaşmasını sağlayan iğneyi çekmeden önce yağ yastığında 5 s tutmaya devam edin.
7. Steril 5-0 emilemez dikiş kullanarak cilt kesilerini dikiş atarak kapatın.
8. Ameliyattan sonra, hayvanları temiz bir kafese geri koyun ve iyileşene ve serbestçe hareket edene kadar izleyin (~1-2 dakika sonra). Ameliyattan 24 saat içinde bir hayvanın sağlığı iyi görünmüyorsa, buprenorfin (0.2 mg / kg) sürün.
9. Ameliyattan sonra anestezi altında dikişleri çıkarın (bkz. adım 2.1) 7 d.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation