Ortopisk injektion: Implantering vævsspecifikke kræftceller i en voksen mus

Overview

Videoen viser brystkræft orthotopic podning teknik i en mus model. Denne teknik producerer en høj tumorigenese sats med mindre variation i tumor størrelse og form i forhold til subkutane eller ikke-kirurgisk injektion.

Protocol

1. Forberedelse af celler (til 10 mus)

BEMÆRK: Cellerne skal vaccineres inden for 1 time efter at være blevet løsrevet fra skålen for at undgå nedsat celle levedygtighed. Specifikt bør celleaffjedringen blandes i den gelatineholdige proteinblanding inden for 15 minutter efter at have løsnet cellerne fra skålen for at opretholde deres levedygtighed.

1. Kultur 4T1-luc2 celler, en mus mammary adenocarcinoma celle linje udtrykke luciferase, i RPMI 1640 medier med 10% FBS i en befugtet inkubator ved 37 °C i 5% CO₂.
2. De vedhængende 4T1-luc2 celler vaskes i en 10 cm skål med fosfatbufferet saltvand (PBS) ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette. Der tilsættes 1 mL 0,25 % trypsin ved hjælp af en P1000-pipette, og prøven inkuberes derefter ved 37 °C i 5 min. Derefter tilsættes 4 mL vækstmedier (RPMI-1640 med 10% FBS) ved hjælp af en 5 mL serologisk pipette og overfører celleaffjedringen til et 15-mL konisk rør i en vævskulturhætte. Centrifuge celleaffjedringen ved 180 x g i 5 min.
3. Aspirere supernatanten og opsætte cellerne i 2 mL PBS; derefter tælle cellerne ved hjælp af hæmocytometeret.
4. 2 x 10⁶ 4T1-luc2-celler suspenderes i 40 μL kold PBS (pH 7,4, 4 °C) i vævskulturhætten.
5. 40-μL celleaffjedringen blandes med 360 μL af den gelatineholdige proteinblanding i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL på is i vævskulturhætten.
   BEMÆRK: Den endelige koncentration er 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:gelatineagtig proteinblanding). For den ortopiske model (ingen mastektomi) blev der anvendt 1 x^{10 4/20}μL af den endelige koncentration for at undgå at nå eutanasikriterier (tumorstørrelse > 2 cm) inden for to uger.

2. Kræft celle podning

1. Sæt musene i anæstesiinduktionskammeret med 2-4% isofluran og 0,2 L/min iltstrøm, indtil musene trækker vejret roligt (2-3 min).
2. Tag fat i musen og injicere 0,05 mg/kg buprenorphin i skulderen subkutant.
3. Bekræft tilstrækkelig anæstesi ved manglende reaktion på en tå knivspids. Sæt musens næse i hullet i musemasken, som tillader indåndingsbedøvelse med 2-4% isofluran og 2 L/min iltstrøm fastgjort til en kulbeholderenhed.
4. Restrain musens lemmer ved hjælp af lab tape og sterilisere sin hud ved hjælp af klorhexidin, jod, og 75% ethanol, ved hjælp af vatpinde.
5. Lav et 5 mm hudindsnit i midten af den forreste brystvæg ved hjælp af steril mikrodissection saks, løft højre hud ved siden af snittet og løsrive huden fra brystvæggen ved hjælp af saksen, og vend derefter huden for at udsætte den rigtige #2 brystfedtpude.
6. Injicerer forsigtigt 20 μL kræftcelleaffjedring ved hjælp af en 1 mL insulinsprøjte med en 28,5 G nål i fedtpuden under direkte syn gennem såret.
   BEMÆRK: Nålen går gennem såret, ikke huden. Hold kanylen i fedtpuden i 5 s, før du trækker den ud, hvilket giver tid til, at den gelatineagtige proteinblanding størkner.
7. Luk huden indsnit ved syning, ved hjælp af sterile 5-0 ikke-absorberbare suturer.
8. Efter operationen skal du returnere dyrene til et rent bur og overvåge dem, indtil de er kommet sig og bevæger sig frit (efter ~ 1-2 min). Hvis et dyr ikke synes at være ved godt helbred inden for 24 timer efter operationen, skal buprenorphin (0,2 mg/kg) gives.
9. Suturerne fjernes under bedøvelse (se trin 2.1) 7 d efter operationen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation