正位注射：将组织特定癌细胞植入成年小鼠体内

Overview

该视频演示了小鼠模型中的乳腺癌矫型接种技术。与皮下注射或非手术注射相比，该技术产生的肿瘤发生率高，肿瘤大小和形状的变异性较小。

Protocol

1. 细胞准备（10只小鼠）

注：细胞应在与菜分离后1小时内接种，以避免细胞存活率下降。具体来说，细胞悬浮应在将细胞从盘子中分离后15分钟内混合到明胶蛋白混合物中，以保持其生存能力。

1. 培养4T1-luc2细胞，一个小鼠乳腺癌细胞系表达红素酶，在RPMI 1640介质与10%FBS在加湿孵化器在37°C在5%CO_2.
2. 使用 10 mL 血清移液器用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 在 10 厘米的盘子中清洗粘附的 4T1-luc2 细胞。使用 P1000 移液器添加 1 mL 的 0.25% trypsin，然后在 37 °C 下孵化样品 5 分钟。然后，使用 5 mL 血清移液器添加 4 mL 的生长介质（RPMI-1640 与 10% FBS），并将细胞悬架转移到组织培养罩中的 15 mL 锥形管中。将细胞悬浮在 180 x g下 5 分钟。
3. 吸附超自然分子，在PBS的2mL中恢复细胞：然后，使用血细胞仪数一数细胞。
4. 在组织培养罩中将 2 x 10⁶ 4T1-luc2 细胞悬浮在 40 μL 的冷 PBS（pH 7.4， 4 °C）中。
5. 将 40-μL 细胞悬浮液与 360 μL 的明胶蛋白混合物混合在组织培养罩冰上的 1.5 mL 微中量管中。
   注：最终浓度为 1 x 10^5/20μL（1：9 PBS：明胶蛋白混合物）。对于正交模型（无乳房切除术），使用最终浓度的 1 x 10^4/20μL，以避免在两周内达到安乐死标准（肿瘤大小 + 2 厘米）。

2. 癌细胞接种

1. 将小鼠放入麻醉感应室，2-4%异氟兰和0.2L/分钟氧气流动，直到小鼠平静地呼吸（2~3分钟）。
2. 抓住鼠标，将0.05毫克/千克丁丙诺啡注射到其肩部皮下。
3. 确认足够的麻醉缺乏反应的脚趾捏。将鼠标的鼻子插入小鼠面膜的孔中，使吸入性麻醉具有 2-4% 异氟兰和 2 L/min 氧气流连接到木炭罐单元。
4. 使用实验室胶带抑制小鼠的四肢，使用氯西丁、碘和75%乙醇用棉签对皮肤进行消毒。
5. 使用无菌微切除剪刀在胸前壁中间切开 5 毫米皮肤切口，将切口旁边的右侧皮肤抬起，然后用剪刀将皮肤从胸壁上分离出来，然后倒置皮肤，露出右#2乳腺脂肪垫。
6. 使用 1 mL 胰岛素注射器（带 28.5 G 针头）小心地将 20 μL 的癌细胞悬浮剂注射到通过伤口直接视力下的脂肪垫中。
   注：针穿过伤口，而不是皮肤。在拔出针头之前，先将针头放在脂肪垫中5s，这样明胶蛋白混合物才能凝固。
7. 使用无菌 5-0 不可吸收的缝合来缝合皮肤切口。
8. 手术后，将动物放归干净的笼子，并监测它们，直到它们康复并自由移动（约1~2分钟后）。如果动物在手术后24小时内身体状况不佳，服用丁丙诺啡（0.2毫克/千克）。
9. 手术后在麻醉下取出缝合线（见第 2.1 步）7 d。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation