Iniezione Ortotopica: Impianto di cellule tumorali specifiche del tessuto in un topo adulto

Overview

Il video mostra la tecnica di inoculazione ortotopica del cancro al seno in un modello di topo. Questa tecnica produce un alto tasso di tumorigenesi con minore variabilità nelle dimensioni e nella forma del tumore rispetto all'iniezione sottocutanea o non chirurgica.

Protocol

1. Preparazione delle cellule (per 10 topi)

NOTA: Le cellule devono essere inoculate entro 1 h dopo essere state staccate dal piatto per evitare una diminuzione della vitalità cellulare. In particolare, la sospensione cellulare deve essere mescolata nella miscela proteica gelatinosa entro 15 minuti dopo aver staccato le cellule dal piatto per mantenere la loro vitalità.

1. Coltura 4T1-luc2 cellule, una linea cellulare adenocarcinoma mammaria del topo che esprime luciferasi, in supporti RPMI 1640 con 10% FBS in un incubatore umidificato a 37 °C in 5% CO₂.
2. Lavare le cellule aderenti da 4T1-luc2 in un piatto da 10 cm con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 1 mL dello 0,25% di tripina utilizzando una pipetta P1000 e, quindi, incubare il campione a 37 °C per 5 min. Quindi, aggiungere 4 ml di mezzi di crescita (RPMI-1640 con FBS al 10%) utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml in una cappa di coltura tissutale. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 5 min.
3. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 2 mL di PBS; quindi, contare le cellule usando l'emocitometro.
4. Sospendere 2 x 10^{6 cellule} 4T1-luc2 in 40 μL di PBS freddo (pH 7,4, 4 °C) nella cappa di coltura tissutale.
5. Mescolare la sospensione cellulare da 40 μL con 360 μL della miscela proteica gelatinosa in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml sul ghiaccio nella cappa di coltura tissutale.
   NOTA: La concentrazione finale è di 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:miscela proteica gelatinosa). Per il modello ortotopico (nessuna mastectomia), sono stati utilizzati 1 x^{10 4}/20 μL della concentrazione finale, per evitare di raggiungere i criteri di eutanasia (dimensione tumorale > 2 cm) entro due settimane.

2. Inoculazione delle cellule tumorali

1. Mettere i topi nella camera di induzione dell'anestesia con il 2-4% di isoflurane e 0,2 L / min di flusso di ossigeno fino a quando i topi respirano con calma (2-3 minuti).
2. Afferrare il topo e iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina nella spalla per via sottocutanea.
3. Confermare un'anestesia adeguata per la mancanza di reazione a un dito del piedi. Inserire il naso del mouse nel foro della maschera del mouse, che consente l'anestesia inalatoria con isoflurane al 2-4% e 2 L / min flusso di ossigeno attaccato a un'unità di contenitore a carbone.
4. Trattenere gli arti del topo usando nastro da laboratorio e sterilizzare la pelle usando clorexidina, iodio e 75% di etanolo, utilizzando tamponi di cotone.
5. Fai un'incisione cutanea di 5 mm al centro della parete anteriore del torace utilizzando forbici sterili per la microdisezione, solleva la pelle sul lato destro accanto all'incisione e stacca la pelle dalla parete toracica usando le forbici, quindi inverti la pelle per esporre il cuscinetto grasso mammario #2 destro.
6. Iniettare con cura 20 μL di sospensione delle cellule tumorali utilizzando una siringa per insulina da 1 ml con un ago da 28,5 G nel cuscinetto grasso sotto visione diretta attraverso la ferita.
   NOTA: L'ago attraversa la ferita, non la pelle. Continuare a tenere l'ago nel tampone grasso per 5 s prima di estrarlo, il che consente alla miscela proteica gelatinosa di solidificarsi.
7. Chiudere le incisioni cutanee cucendo, utilizzando suture sterili 5-0 non assorbibili.
8. Dopo l'intervento chirurgico, riportare gli animali in una gabbia pulita e monitorarli fino a quando non si sono ripresi e si muovono liberamente (dopo ~ 1-2 minuti). Se un animale non sembra essere in buona salute entro 24 ore dall'intervento chirurgico, somministrare buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Rimuovere le suture in anestesia (vedere fase 2.1) 7 d dopo l'intervento chirurgico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation