Ortotopisk injeksjon: Implantering av vevsspesifikke kreftceller i en voksen mus

Overview

Videoen demonstrerer brystkreft ortotopisk inokulasjonsteknikk i en musemodell. Denne teknikken produserer en høy tumorigenesehastighet med mindre variasjon i tumorstørrelse og form sammenlignet med subkutan eller ikke-kirurgisk injeksjon.

Protocol

1. Forberedelse av celler (for 10 mus)

MERK: Cellene skal inokuleres innen 1 time etter å ha blitt løsnet fra parabolen for å unngå redusert celle levedyktighet. Spesielt bør celleopphenget blandes inn i den gelatinøse proteinblandingen innen 15 minutter etter at cellene er løsnet fra parabolen for å opprettholde deres levedyktighet.

1. Kultur 4T1-luc2 celler, en mus pattedyr adenocarcinoma celle linje som uttrykker luciferase, i RPMI 1640 media med 10% FBS i en fuktet inkubator ved 37 °C i 5% CO₂.
2. Vask de tilhengerne 4T1-luc2 cellene i en 10 cm tallerken med fosfatbufret saltvann (PBS) ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Tilsett 1 ml 0,25% trypsin ved hjelp av en P1000 pipette og inkuber deretter prøven ved 37 °C i 5 minutter. Legg deretter til 4 ml vekstmedier (RPMI-1640 med 10% FBS) ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette og overfør cellefjæringen til et 15 ml konisk rør i en vevskulturhette. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 180 x g i 5 min.
3. Aspirer supernatanten og resuspend cellene i 2 ml PBS; Tell deretter cellene ved hjelp av hemocytometeret.
4. Suspender 2 x 10⁶ 4T1-luc2 celler i 40 μL kald PBS (pH 7,4, 4 °C) i vevskulturhetten.
5. Bland 40-μL cellefjæring med 360 μL av den gelatinøse proteinblandingen i et 1,5 ml mikrosenterrør på is i vevskulturhetten.
   MERK: Den endelige konsentrasjonen er 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:gelatinøs proteinblanding). For den ortotopiske modellen (ingen mastektomi) ble 1 x 10⁴/20 μL av den endelige konsentrasjonen brukt, for å unngå å nå eutanasikriterier (tumorstørrelse > 2 cm) innen to uker.

2. Kreftcelle inokulering

1. Sett musene i anestesiinduksjonskammeret med 2-4% isofluran og 0,2 l / min oksygenstrøm til musene puster rolig (2-3 min).
2. Ta tak i musen og injiser 0,05 mg/kg buprenorfin i skulderen subkutant.
3. Bekreft tilstrekkelig anestesi ved mangel på reaksjon på tåklemme. Sett musens nese inn i hullet på musemasken, noe som gjør det mulig å inhalere anestesi med 2-4% isofluran og 2 l / min oksygenstrøm festet til en kullbeholderenhet.
4. Hold musens lemmer ved hjelp av laboratoriebånd og steriliser huden ved hjelp av klorhexidin, jod og 75% etanol, ved hjelp av bomullspinne.
5. Lag et 5 mm hudinnsnitt midt i den fremre brystveggen ved hjelp av steril mikrodesisseksjonssaks, løft høyre sidehud ved siden av snittet og løsne huden fra brystveggen ved hjelp av saksen, og inverter deretter huden for å eksponere riktig #2 mammaryfettpute.
6. Injiser forsiktig 20 μL kreftcellefjæring ved hjelp av en 1 ml insulinsprøyte med en 28,5 G nål i fettputen under direkte syn gjennom såret.
   MERK: Nålen går gjennom såret, ikke huden. Hold nålen i fettputen i 5 s før du trekker den ut, noe som gir tid til den gelatinøse proteinblandingen å størkne.
7. Lukk hudinnsnittene ved å sy, ved hjelp av sterile 5-0 ikke-absorberbare suturer.
8. Etter operasjonen, returner dyrene til et rent bur og overvåk dem til de har kommet seg og beveger seg fritt (etter ~ 1-2 min). Hvis et dyr ikke ser ut til å ha god helse innen 24 timer etter operasjonen, administrer buprenorfin (0,2 mg/kg).
9. Fjern suturene under anestesi (se trinn 2.1) 7 d etter operasjonen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation