Índia Inflação de tinta: um método de coloração para visualizar nódulos tumorais

Overview

Este vídeo descreve a inflação da tinta índia - um método de coloração - para quantificar nódulos tumorais em pulmões de camundongos portadores de tumores. Após a coloração, os pulmões são fixados na solução de Fekete para observar nódulos tumorais nos pulmões.

Protocol

1. Validação de Metástases Pulmonares Usando a Inflação da Tinta Índia de pulmões portadores de tumores

NOTA: Para validar os resultados de imagens de tumores vivos da luciferase, realize a inflação de tinta da Índia dos pulmões do camundongo portador de tumores para quantificar nódulos tumorais. As células 4T1 também se metástases para outros órgãos e tecidos (Figura 1) e, portanto, o exame histológico desses órgãos para validar a metástase tumoral deve ser realizado se necessário. Este protocolo usa a metástase pulmonar como exemplo.

1. Mantenha os ratos em sua gaiola de casa existente para eutanásia. Quando alojados com outros animais, realoque esses ratos não sendo eutanizados para uma gaiola diferente.
2. Remova a parte superior do filtro da gaiola e substitua-a pela parte superior do filtro de CO2. Ligue o cilindro de gás CO2 comprimido (100%) que está conectado à parte superior do filtro de CO2. Defina a vazão em 2 L/min e mantenha o CO2 ligado por pelo menos 10 minutos. Se os ratos ainda estiverem respirando no final de 10 minutos, deixe o CO2 ligado até pelo menos 1 minuto depois que os ratos pararem de respirar. Desligue o controle do cilindro de CO2 e o medidor de fluxo. Aguarde mais 3 minutos e remova a parte superior do filtro.
3. Coloque o rato sacrificado de costas em uma tábua de poliestireno. Fixar as pernas para garantir o acesso desobstruído à traqueia. Pulverizar os ratos com 70% de etanol.
4. Usando uma tesoura, corte ao longo da linha média do abdômen médio do rato através da caixa torácica e até as glândulas salivares. Observe a traqueia. Use fórceps para remover tecidos ao redor da traqueia para expor a traqueia.
5. Enfie uma ponta de pipeta por baixo da traqueia. Segurando a ponta com uma mão, levante suavemente a traqueia para cima e para longe do corpo.
6. Gire a plataforma segurando o mouse 180°. Use uma seringa de tuberculina de 1/2 CC 27 G 1/2 para injetar tinta índia (tinta 10% índia e hidróxido de amônio 0,1%) nos pulmões através da traqueia. Infle completamente os pulmões com tinta até que uma forte resistência seja sentida.
7. Use uma tesoura para cortar a traqueia. Use fórceps para segurar o rato e inserir outro conjunto de fórceps sob os pulmões e puxar os lóbulos pulmonares para fora do rato. Enxágüe os pulmões brevemente em um béquer contendo água.
8. Em uma capa de fumaça química, transfira os pulmões para um frasco de cintilação de vidro contendo 3 ml da solução de Fekete (50% etanol, 6% formaldeído e 3% ácido acético glacial). Tampe o frasco para evitar que a solução evapore.
   NOTA: Os tecidos podem ser armazenados na solução de Fekete indefinidamente.
9. Após alguns minutos, observe nódulos tumorais como pontos brancos nos pulmões negros(Figura 1). O nódulo do tumor branco é visível pelos olhos. Transfira os pulmões para um prato em um capô de fumaça e conte o número de manchas brancas. Cada mancha branca representa um único nódulo tumor metastático.

Representative Results

Figura 1. Visualização de nódulos tumorais pulmonares pela India Ink Inflation. O pulmão do camundongo portador de tumor foi inflado com tinta índia e fixado na solução de Fekete. Os pontos brancos são metástases pulmonares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620