India blekk inflasjon: en farging metode for å visualisere tumor knuter

Overview

Denne videoen beskriver india blekk inflasjon - en farging metode - å kvantifisere tumor knuter i tumorbærende mus lunger. Etter farging er lungene festet i Feketes løsning for å observere tumorknuter i lungene.

Protocol

1. Validering av lungemetastaser ved hjelp av India blekkinflasjon av tumorbærende lunger

MERK: For å validere resultatene av luciferase levende tumoravbildning, utfør India blekkinflasjon av tumorbærende muse lunger for å kvantifisere tumorknuter. 4T1 celler metastasererer også til andre organer og vev (figur 1) og derfor bør histologisk undersøkelse av disse organene for å validere tumormetastase utføres om nødvendig. Denne protokollen bruker lungemetastase som eksempel.

1. Hold mus i deres eksisterende hjemmebur for eutanasi. Når de ligger med andre dyr, flytt de musene som ikke blir euthanized til et annet bur.
2. Fjern burfilterplaten og erstatt den med CO2-filterplaten. Slå på den komprimerte CO2-gassflasken (100 %) som er koblet til CO2-filtertoppen. Still inn strømningshastigheten på 2 l/min og hold CO2 på i minst 10 minutter. Hvis musene fortsatt puster på slutten av 10 min, la CO2 på til minst 1 min etter at musene slutter å puste. Slå av CO2-sylinderkontrollen og strømningsmåleren. Vent i 3 minutter til, og fjern filtertoppen.
3. Plasser den ofrete musen på ryggen på et polystyrenbrett. Fest bena for å sikre uhindret tilgang til luftrøret. Spray musene med 70% etanol.
4. Bruk en saks, kutt langs midtlinjen av musens midtliv gjennom ribbeina og opp mot spyttkjertlene. Vær oppmerksom på luftrøret. Bruk tang for å fjerne vev rundt luftrøret for å eksponere luftrøret.
5. Tre en pipettespiss under luftrøret. Hold spissen med en hånd, løft luftrøret forsiktig opp og bort fra kroppen.
6. Roter plattformen med musen 180°. Bruk en 1/2 CC 27 G 1/2 tuberkulinsprøyte for å injisere India Ink (10% India blekk og 0,1% Ammoniumhydroksid) i lungene via luftrøret. Blås helt opp lungene med blekk til en sterk motstand er følt.
7. Bruk en saks til å kutte luftrøret. Bruk tang til å holde musen og sette inn et annet sett med tang under lungene og trekke lungelobene ut av musen. Skyll lungene kort i et beger som inneholder vann.
8. I en kjemisk avtrekkshette, overfør lungene til et hetteglass med glassscullering som inneholder 3 ml Feketes oppløsning (50% etanol, 6% formaldehyd og 3% glasial eddiksyre). Hette hetteglasset for å forhindre at oppløsningen fordamper.
   MERK: Vevet kan lagres i Feketes løsning på ubestemt tid.
9. Etter noen minutter, observere tumor knuter som hvite prikker på de svarte lungene (Figur 1). Den hvite svulst nodule er synlig av øynene. Overfør lungene til en tallerken i en avtrekkshette og tell antall hvite flekker. Hver hvit flekk representerer en enkelt metastatisk tumor nodule.

Representative Results

Figur 1. Visualisering av lunge tumor knuter av India Ink Inflation. Lungen til den tumorbærende musen ble oppblåst med India blekk og festet i Feketes løsning. De hvite prikkene er lungemetastaser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620