India Ink Inflation: un metodo di colorazione per visualizzare i noduli tumorali

Overview

Questo video descrive l'inflazione dell'inchiostro indiano, un metodo di colorazione, per quantificare i noduli tumorali nei polmoni del topo che portano il tumore. Dopo la colorazione, i polmoni vengono fissati nella soluzione di Fekete per osservare i noduli tumorali nei polmoni.

Protocol

1. Convalida delle metastasi polmonari utilizzando l'inflazione dell'inchiostro indiano dei polmoni portanti di tumore

NOTA: Per convalidare i risultati dell'imaging tumorale vivo della luciferasi, eseguire l'inflazione dell'inchiostro indiano dei polmoni del topo portanti il tumore per quantificare i noduli tumorali. Le cellule 4T1 si metastasi anche ad altri organi e tessuti (Figura 1) e, pertanto, l'esame istologico di questi organi per convalidare la metastasi tumorale deve essere eseguito se necessario. Questo protocollo usa la metastasi polmonare come esempio.

1. Tieni i topi nella gabbia domestica esistente per l'eutanasia. Quando sono ospitati con altri animali, delocalizzare quei topi che non vengono eutanasiati in una gabbia diversa.
2. Rimuovere il piano del filtro della gabbia e sostituirlo con il piano del filtro CO2. Accendere la bombola di gas CO2 compressa (100%) collegato alla parte superiore del filtro co2. Impostare la portata a 2 L/min e mantenere la CO2 per almeno 10 minuti. Se i topi respirano ancora alla fine di 10 minuti, lasciare la CO2 su fino ad almeno 1 minuto dopo che i topi hanno smettereo. Disattivare il controllo del cilindro di CO2 e il misuratore di portata. Attendere altri 3 minuti e rimuovere la parte superiore del filtro.
3. Posizionare il topo sacrificato sulla schiena su una tavola di polistirolo. Fissare le gambe per garantire un accesso senza ostacoli alla trachea. Spruzzare i topi con il 70% di etanolo.
4. Usando un paio di forbici, tagliare lungo la linea mediana dell'addome medio del topo attraverso la gabbia toracica e verso le ghiandole salivari. Osserva la trachea. Utilizzare le forcelle per rimuovere i tessuti che circondano la trachea per esporre la trachea.
5. Infilare una punta di pipetta sotto la trachea. Tenendo la punta con una mano, sollevare delicatamente la trachea su e lontano dal corpo.
6. Ruotare la piattaforma tenendo il mouse di 180°. Utilizzare una siringa tubercocina 1/2 CC 27 G 1/2 per iniettare inchiostro indiano (10% inchiostro indiano e 0,1% idrossido di ammonio) nei polmoni attraverso la trachea. Gonfiare completamente i polmoni con l'inchiostro fino a quando non si sente una forte resistenza.
7. Usa un paio di forbici per tagliare la trachea. Utilizzare le forcep per tenere il mouse e inserire un altro set di forcep sotto i polmoni ed estrarre i lobi polmonari dal mouse. Risciacquare brevemente i polmoni in un becher contenente acqua.
8. In una cappa chimica, trasferire i polmoni in una fiala a scintillazione di vetro contenente 3 ml della soluzione di Fekete (50% etanolo, 6% formaldeide e 3% acido acetico glaciale). Limitare il flaconcino per evitare che la soluzione evapori.
   NOTA: I tessuti possono essere conservati nella soluzione di Fekete indefinitamente.
9. Dopo alcuni minuti, osservare i noduli tumorali come punti bianchi sui polmoni neri (Figura 1). Il nodulo tumorale bianco è visibile dagli occhi. Trasferire i polmoni in un piatto in un cappuccio di fumi e contare il numero di macchie bianche. Ogni macchia bianca rappresenta un singolo nodulo tumorale metastatico.

Representative Results

Figura 1. Visualizzazione dei noduli del tumore del polmone da parte dell'inflazione di inchiostro dell'India. Il polmone del topo che porta il tumore è stato gonfiato con inchiostro indiano e fissato nella soluzione di Fekete. I punti bianchi sono metastasi polmonari.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620