Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/206

Summary

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Реакция обратной транскриптазы

Включите нагревательный блок до 70-80 ° С и 42 ° C. Водяные бани также может быть использован в этом шаге. При использовании нагрева блоков, положить немного воды так, чтобы тепло равномерно.

  1. Грунтовка реакции
    1. Принимать 3 мкг РНК
    2. Регулировка громкости до 13 мкл водой РНКазы свободный
    3. Добавить 2,5 мкл случайных гексамера праймеров (2mg/mL)
  2. Хорошо перемешать и инкубировать при 70-80 ° С в течение 8 минут. Затем поместите на льду в течение 5 мин.
  3. Подготовка РТ коктейль (14,5 мкл / Rxn):

    Компонент Объем
    5X первых буфера Strand 6 мкл
    0,1 М ДТТ
    3 мкл
    25X aminoallyl-дНТФ смеси 1,2 мкл
    Надстрочный II RT (200U/μl) 2,3 мкл
    Воды
    2,0 мкл

    * Для реакций п, подготовка Master Mix для п 0,5 порции коктейля, чтобы заверить, что вы не закончатся.

  4. Добавить 14,5 мкл до охлаждения реакций.
  5. Mix (не вихря) и инкубировать при 42 ° С в течение 3-4 часов
  6. Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.

Гидролиза РНК

  1. Для каждого образца, добавляют 3 мкл 1 N NaOH и 0,6 мкл 0,5 М ЭДТА. (Финальный conc.s = 100мм NaOH, 10 мМ ЭДТА)
  2. Смешать и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 10 минут.
  3. Нейтрализовать добавлением 33,6 мкл 1М HEPES, рН = 7,0 (конечная конц .= 500 мм HEPES)
  4. Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.

Реакция очистка: Удаление неинкорпорированных аа-dUTP и свободные амины

Примечание: Это очищение протокол изменяется от PCRpurification Qiagen протокол QIAquick комплект. Мыть фосфата и элюирования буферов заменить Qiagen поставляется буферов потому Qiagen буферы содержат свободные амины, которые конкурируют с реакции сочетания Cy красителя. Столбцы из мини-приготовительные комплект может также использоваться.

  1. Смешайте кДНК реакции с 300 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 336 мкл) буфера PB (Qiagen входит в комплект) и трансфер в колонке QIAquick.
  2. Место колонки в 2 мл пробирки (Qiagen входит в комплект) и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции.
  3. Чтобы промыть, добавить 750 мкл промывочного буфера фосфата (не Qiagen), чтобы колонны и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
  4. Пустые пробирки и повторить 750 мкл мыть и центрифугирования шаг.
  5. Пустые пробирки и центрифуги колонки еще 1 минуту при максимальной скорости.
  6. Передача столбец на новое 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера для элюции фосфата. (См. раздел приготовления раствора)
  7. Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  8. Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты.
  9. Элюировать второй раз (и еще 30 мкл фосфатного буфера элюирования) в ту же трубку, повторив шаги 6-8. Конечный объем элюирования должно быть ~ 60 мкл.
  10. Количество кДНК может быть определена количественно на этом этапе:
    нг кДНК = (коэффициент разбавления) (OD260) (37) (общий объем вымывают из колонки)
  11. Сухой образец в вакууме скорость при 45 ° C.
  12. Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.

Муфта аа-кДНК Су Dye Эстер

  1. Ресуспендируют aminoallyl меченные кДНК с 10 мкл 50 мМ Na-бикарбонат, рН = 9,0, если необходимо. (Этот буфер должен быть свежим каждые две недели)
  2. Работа в темном месте, добавить зонда трубка соответствующего красителя Су. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендирования красителя.
  3. Инкубируйте реакции в течение 1 часа в темном месте при комнатной температуре. (Инкубация может доходить до двух часов)

Реакция Очистка II: Удаление несвязанных красителя

  1. К реакционной добавить 35 мкл 100 мМ NaOAc рН 5,2. Тщательно перемешать.
  2. Добавить 250 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 225 мкл) буфера PB (Qiagen прилагается) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Место колонке QIAquick спина в 2 мл пробирки (Qiagen в комплект поставки), применять образец столбца, а центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции.
  4. Чтобы промыть, добавить 0,75 мл буфера PE (Qiagen в комплект поставки) к колонне и центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты.
  5. Повторите шаг 4.
  6. Пустая труба сбора и центрифуги колонку еще на 1 минуту при максимальной скорости.
  7. Место колонку в чистую 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера EB (Qiagen в комплект поставки) к центру колонки мембраны.
  8. Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  9. Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты.
  10. Элюировать второй раз в ту же трубку, повторяяшаги 7-9. Окончательный элюировали объем должен быть ~ 60 мкл.

Анализ маркировки Реакция

Количество кДНК и метка может быть определена количественно на этом этапе:

  • Мера 260 OD, 550 и 650 (Бланк является вода.) Используйте nanodrop программы микрочипов.
  • Рассчитать пмоль красителей регистрации и пмоль ДНК и пис / красителя отношения с заданными уравнениями ниже:

    пмоль нуклеотидов = [OD260 * объем (мкл) * 37 нг / мкл * 1000 пг / нг] / 324,5 пг / пмоль

Примечание: 1 OD260 = 37 нг / мкл для кДНК; 324,5 пг / пмоль средней молекулярной массой дНТФ)
пмоль Cy3 = OD550 * объем (мкл) / 0,15
пмоль Cy5 = OD650 * объем (мкл) / 0,25
нуклеотидов / красителя соотношение = пмоль кДНК / пмоль Су красителя

Если вы используете nanodrop, это уже дает пмоль / мкл для каждого красителя. Вам нужно только умножить это число на объем, чтобы получить общее пмоль включению красителя.

Обратите внимание:> 150-200 пмоль красителя включения в образец и отношение менее 20 нуклеотидов / молекул красителя является оптимальным для гибридизации.

  • Образцы могут храниться при температуре -20 ° С в темноте.
    • Комбинат зонды для гибридизированных вместе и сухой вниз в speedvac на 42 ° C.
    • Образцы могут храниться при температуре -20 ° С до готовности Hyb.

Предварительно Hyb слайдов

  1. Лицо Место сползают вниз по РТ 100 мл воды в чистую красный держатель слайдов в течение 3-5 минут
  2. Привязка сухой слайд, поставив лицом вверх на 100 ° Блок отопления С в течение нескольких секунд - следите за конденсации исчезают
  3. УФ перекрестные ссылки слайд при 250 mJoules (Введите 2500 до УФ сшивателя)
  4. Гидратов слайды, опуская в предварительно разогретой воды 42 ° C. Спиновые 5 мин при 700 RPM при комнатной температуре.
  5. Инкубируйте слайдов в 50 мл банку Коплин содержащие подогретого предварительно Hyb (5XSSC, 1% БСА, 0,1% SDS) не менее 45 минут при 42 ° С, а инкубационный может идти дольше, если это необходимо.

    50 мл предварительно Hyb буфера: 12,5 мл 20х SSC, 10 мл 5% БСА, 0,5 мл 10% SDS, 27 мл воды

  6. Dip слайдов в подогретого воде (42 ° С) и агитировать за пару минут, чтобы удалить предварительно Hyb буфера.
  7. Полоскание в изопропанола и спина 5 мин при 700 оборотах в минуту, комнатной температуры, чтобы высохнуть.

Подготовка образцов для гибридизации

  1. Ресуспендируют зонд в воде (объемы приведены ниже)

    Для общего об. = 30μl
    Для общего об. = 35μl
    Для полной том .= 40μl
    19,8 мкл воды
    23,55 мкл воды
    27,2 мкл воды

    1,5 мкл 1,5 мкл 1,5 мкл 10 мг / мл ДНК спермы лосося (Invitrogen)
    1,2 мкл 1,2 мкл 1,2 мкл 12,5 мг / мл тРНК
    4,5 мкл 5,25 мкл 6 мкл 20XSSC (3X окончательный)
    3 мкл 3,5 мкл 4 мкл 1% SDS

    Примечание: порядок добавления реагентов важны. Не готовьте мастера микса.

  2. Кипятить 5 минут, затем спина 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Прохладный в течение 2 мин при комнатной температуре.

Гибридизация

  1. Добавить 10-12 мкл 3Х SSC для скважин гибридизации камеры на каждом краю и в центре.
  2. Добавить чистой скольжения ручка для соответствующей области слайда и аккуратно нагрузки в гибридизации решения (30 -40 мкл). Там должно быть очень образца на обеих боковых покровным стеклом.
  3. Место слайда в камере. Затяните винты и места в 65 ° С водяной бане в течение ночи. Не устанавливайте камеру непосредственно на дно ванны. Место блока в верхней части верхней камере провести все на месте. Держите крышкой на водяной бане для защиты светочувствительных образцов.

Hyb Моет

  1. Подготовьте следующие буферов:
    • 1X SSC, 0,05% SDS
    • 0,06 X SSC
  2. После инкубации распечатать камеру гибридизации. Удалить слайд из камеры, следя за тем, чтобы не нарушить покровное.
  3. Для удаления покровные, погрузи слайдов в блюдо с теплой 1X SSC, 0,05% SDS промывочный буфер покровное направлен к нижней части блюда. Покровное будет падать, перемещая слайд стороны в сторону.
  4. После покровное удаляется, место слайда в стойку свежие ванну с теплой 1XSSCm 0,05% SDS. Агитировать за пару минут
  5. Передача слайдами плюс стойки для ванны 0,06 X SSC.
  6. Передача слайдов на другой бам на 0,06 X SSC содержащие свежие стойку, промокательной слайд на бумажное полотенце, чтобы удалить как можно больше SDS-содержащих буфера возможно прежде, чем поместить на свежем ванну.
  7. Перемешивают слайды в течение нескольких минут.
  8. Спиновые сразу при комнатной температуре в течение 5 мин при 700 оборотах в минуту, то слайды готов к сканированию. Хранить в темноте, пока проверяются.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
AA-dUTP Sigma-Aldrich A0410 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP Amersham 27-2035-01 100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers Amersham 27-2166-01 3mg/mL
SuperScript III RT Invitrogen 80800444 200U/μL
CyDye™ Amersham RPN5661 Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick Qiagen 28104 PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4 Buffer To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer Buffer For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer Buffer Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. Forthcoming.
  2. Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. Forthcoming.
  3. Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. Forthcoming.
Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beyhan, S., Yildiz, F. Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays. J. Vis. Exp. (4), e206, doi:10.3791/206 (2007).More

Beyhan, S., Yildiz, F. Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays. J. Vis. Exp. (4), e206, doi:10.3791/206 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter