Questo protocollo utilizza un pull down di analisi per determinare i livelli di attivo GTPasi RhoC all'interno delle cellule.
Abstract
RhoC GTPasi ha il 91% di omologia RhoA GTPasi. A causa della sua diffusione nelle cellule, reagenti e tecniche per molti RhoA GTPasi sono stati sviluppati. Tuttavia, RhoC GTPasi è espressa nelle cellule tumorali metastatiche a livelli relativamente bassi. Quindi, pochi RhoC reagenti specifici sono stati sviluppati. Abbiamo adattato un test per rilevare l'attivazione Rho GTPasi RhoC. Questa tecnica utilizza un GST-Rho legame proteina di fusione del dominio a tirare fuori attivo GTPasi RhoC. Inoltre, siamo in grado di raccogliere proteine totali all'inizio del test per determinare i livelli di totale (GTP e PIL legato) GTPasi RhoC. Questo permette la determinazione di principi attivi rispetto al totale delle GTPasi RhoC nella cella. Diverse versioni commerciali di questa procedura sono stati sviluppati tuttavia, i kit commerciali sono ottimizzati per RhoA GTPasi e di solito non funzionano bene per RhoC GTPasi. Parti del test sono stati modificati, nonché lo sviluppo di una RhoC-anticorpo specifico.
Protocol
1. Preparare GST-fusione delle proteine Le scorte di glicerolo di batteri competenti JM109 contenenti il primo N-terminale di 90 amminoacidi di Rho rhotekin dominio di legame (RBD) subcloned nel pGEX3x BamH1/EcoR1 vettore sono fatti. Al fine di garantire alta efficienza Le seguenti operazioni devono essere eseguite per ogni esperimento. Nella nostra esperienza, preparati al momento GST-RBD è la chiave per un test GTPasi robusto e preciso di attivazione. Aggiungere 50 microlitri (…
Discussion
La fase più critica della procedura è la generazione di nuove GST-RBD. Il mancato prestare molta attenzione a questo passo è motivo principale per il fallimento. Tutte le fasi, dalla generazione del GST-RBD (1,2) per la notte di incubazione con il lisato cellulare (2,5), dovrebbe essere fatto in un solo giorno. Un altro passo fondamentale è quello di rendere certo che ci sono cellule sufficienti per produrre la lisati cellulari. Questo è di particolare importanza quando si guarda RhoC GTPasi, che tende ad essere pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dipartimento della Difesa W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 e W81XWH-08-1-0356