Summary
ويقدم طريقة جديدة لمراقبة تنوعا من دوران الأوعية الدقيقة. فهو يعتبر مناسبة للمراقبة على المدى الطويل ، وعلى تركيبة مع التدخلات البيولوجية pharmacophysiological أو الجزيئي.
Abstract
معلومات أساسية : العوامل التنظيمية والفيزيولوجيا مفصل في الجسم الحي دوران الأوعية الدقيقة ظلت لم تتضح تماما بعد طرائق عديدة ومختلفة من التصوير قد اخترعت. في حين أن العديد من المعلمات العيانية تدفق الدم تعكس سرعة تدفق ، والتغيرات في سرعة تدفق الدم وخلايا الدم الحمراء (RBC) متقلب لا تعقد العلاقة الخطية في هذه الملاحظات المجهرية. هناك تقارير عن التفاوت بين سرعة وتدفق RBC RBC ، RBC تدفق البلازما وحجم التدفق والتنوع المكاني والزماني للتنظيم التدفق في الأنسجة الطرفية في الملاحظات المجهرية ، والأساس العلمي لشرط دراسات أكثر تفصيلا في مجال تنظيم استخدام microcirculatory intravital المجهري.
الطريقة : نحن تعديل طريقة جيف يختمن من الملاحظة المجهرية في الجسم الحي للعضلات القصية الخشائية الماوس. الفئران هي تخدير التهوية ، وحقنوا PKH26L fluorescently كرات الدم الحمراء ، المسمى لمراقبة مجهرية.
نتائج واستنتاجات : تم الكشف عن كرات الدم الحمراء وfluorescently المسمى حاليا بشكل جيد من قبل المجهر واسعة المجال. تقلص العضلات التي حركها زيادة التحفيز الكهربائي يتسبب في تدفق RBC. والكمي للمعلمات أخرى بما في ذلك السرعة والكثافة الشعرية RBC ممكنا. التسامح مع الفئران جيدا لعملية جراحية ، وحقن من كرات الدم الحمراء الملطخة ، والمراقبة المجهرية ، والتحفيز الكهربائي. لم يلاحظ أي ضرر العضلات أو الدم السفينة ، مما يوحي بأن لدينا وسيلة نسبيا أقل الغازية وملاءمة لفترة طويلة الأجل الملاحظات.
Protocol
RBC غشاء تلوين
- تم تصحيح خلايا الدم الحمراء الماوس من سلالة الفأر نفسه مع heparinization.
- وكانت ملطخة الماوس RBC مع PKH26 صبغ (551/567 نانومتر ؛ الأحمر رابط الخلية الفلورسنت عدة ، سيغما ، الولايات المتحدة).
- وجرفت المياه RBC في برنامج تلفزيوني وحضنت مع الحل 2μM PKH26 من صبغ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وكان رد الفعل توقفت بإضافة البلازما (المعطل الحرارة لمدة 1 ساعة على 65 درجة مئوية مسبقا) وحضنت لمدة 1 دقيقة.
- تم غسلها RBC الملون 5 مرات مع برنامج تلفزيوني.
إعداد الماوس
- واستخدمت ثلاثة إلى ستة أشهر من العمر من الذكور C57BL/10 الفئران في هذه الدراسة. نحن تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (50mg/kgBW).
- ثم كانت intubated الفئران مع أنبوب البولي ايثيلين عيار 20 ، التهوية الميكانيكية ، وارتفعت درجة حرارة بلغت 37 درجة مئوية على المدفأة ورقة Kapton متصلة الاستشعار الحرارية ونظام التغذية المرتدة وحدة تحكم في درجة الحرارة.
- وكان حليق الجانب البطني من الرقبة. تعرض عضلات اليمين واليسار القصي الخشائي. وقدم الدعم للعضلات من جانب صاحب الفولاذ المقاوم للصدأ وsuperfused مع محلول معقم رينغر كريبس.
حقن
- وقد تحسنت في كرات الدم الحمراء الملطخة 37 درجة مئوية ، مع المخفف رينغر كريبس. تم حقن 50ul من RBC الملون (الهيماتوكريت 12 ٪) في الماوس من الوريد القضيب.
مراقبة مجهرية في الجسم الحي من عضلات الهيكل العظمي
تابعنا جيف جورج يختمن 'ق مع تعديل طريقة 1 :
- وضعت الحيوانات على لوحة التدفئة على أعلى مرحلة الحديد المصنوعة يدويا من المجهر الكسوف - 800 نيكون. وقد استخدمت المياه غمس عدسات موضوعية لرصد البرنامج الموسع للتمنيع ، فلوري حية. لاحظنا PKH26 RBC الملون داخل الأوعية الدموية التي تتدفق من تحت ضوء مصباح الفلورسنت من عطارد. حددنا الشرايين الابتدائي ، الثانوي الشرايين والشعيرات الدموية والأوردة التي توجهاتها تدفق كرات الدم الحمراء وأبنية.
- تم تركيب كاميرا SIT المكثف (هاماماتسو الضوئيات ، C2400 ، اليابان) والمختطف الإطار الفيديو لالتقاط إشارة كثافة منخفضة بمعدل الفيديو في الوقت الحقيقي (30 لقطة في الثانية). وسجلت الصور على دي في دي وملفات الفيديو.
تحفيز العضلات
- ولدت نبضة كهربائية باستخدام تحفيز الأعصاب الطرفية (Innervator 252 ، فيشر آند بيكل الرعاية الصحية ، ونيوزيلندا) ، وتسليمها الى سطح العضلات عبر المسبار مطلي. وضعت نهاية لتحقيق ناقص في الجزء القريب من العضلات ، وكان وضع نهاية زائد على الجزء الأعلى من العضلات. أعطيت التحفيز الكزاز بمعدل 50HZ لمدة 5 ثوان. لم المحفزات الكهربائية لا تسبب الضرر المباشر myofiber على مقربة من منطقة التماس.
تحليل تدفق RBC
- تم نقل الصور المسجلة فيديو دي في دي ملفات الفيديو صورة سافانت من خلال برامج المختطف الإطار (فيديو سافانت ، الولايات المتحدة). وجرى استعراض صور الفيديو في سرعة تعديلها من أجل تصور RBC ملطخة الفردية. وقد تم قياس تدفق RBC RBC عن طريق العد ، والتي طارت من خلال شرين الأولية ركز في الدقيقة الواحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقاط هامة techinical هي كما يلي : (1) الحفاظ على الوضع الفسيولوجي للحيوان (التهوية ، ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة حل perfusative الجسم ،) ، (2) حجم حقن RBC الملون ، والظروف (3) لمراقبة (عدسة الأمثل الاختيار ، وكثافة مضان). التطبيقات المحتملة في المستقبل هي على النحو التالي : (أ) بالاشتراك مع التدخلات البيولوجية pharmacophysiological و / أو الجزيئية ، (ب) على المدى الطويل مراقبة الشريان / arteriolo التصلب واتساع الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وجرى استعراض كافة الإجراءات المتصلة التجارب على الحيوانات والتي وافقت عليها اللجنة الفرعية لرعاية الحيوان البحوث من مستشفى ماساتشوستس العام.
Acknowledgments
نشكر ليختمن JW نصيحته في المراقبة المجراة في العضلات.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
