In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Summary

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

Abstract

ACHTERGROND: Regulatory factoren en gedetailleerde fysiologie van in vivo microcirculatie zijn gebleven niet volledig duidelijk na vele verschillende modaliteiten van beeldvorming had uitgevonden. Terwijl veel macroscopische parameters van de bloedstroom reflecteren stroomsnelheid, veranderingen in de snelheid van de bloedstroom en rode bloedcellen (RBC) flux heeft lineaire relatie niet te houden in de microscopische waarnemingen. Er zijn meldingen van discrepantie tussen RBC snelheid en RBC flux, RBC flux en plasma flow volume, en van de ruimtelijke en temporele heterogeniteit van debietregeling in de perifere weefsels in microscopische waarnemingen, een wetenschappelijke basis voor de eis van meer gedetailleerde studies in microcirculatie regelgeving met behulp van intravitale microscopie.

METHODEN: We gewijzigd Jeff Lichtman de methode van in vivo microscopische observatie van de muis musculus sternocleidomastoideus spieren. Muizen zijn verdoofd, geventileerd, en geïnjecteerd met PKH26L-fluorescent gelabelde rode bloedcellen voor microscopisch observatie.

RESULTAAT & CONCLUSIES: fluorescent gelabelde RBC worden gedetecteerd en goed herkenbaar aan een wide-field microscoop. Spiercontractie opgewekt door elektrische stimulatie geïnduceerde toename van RBC flux. Kwantificering van andere parameters zoals RBC snelheid en de capillaire dichtheid waren haalbaar zijn. Muizen goed verdragen de operatie, injectie van gebrandschilderd RBC, microscopische observatie, en elektrische stimulatie. Geen spieren of bloedvaten zijn aangetast werd waargenomen, wat suggereert dat onze methode is relatief minder invasieve en geschikt voor lange-termijn observaties.

Protocol

RBC membraankleuring

1. Muis rode bloedcellen werden gecorrigeerd uit dezelfde muizenstam met heparinization.
2. Muis RBC werden gekleurd met PKH26 kleurstof (551/567 nm; Red fluorescent cel linker kit, Sigma, USA).
3. RBC werden gewassen in PBS en geïncubeerd met 2μM oplossing van PKH26 kleurstof gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De reactie werd gestopt door het toevoegen van plasma (geïnactiveerd met warmte gedurende 1 uur bij 65 ° C op voorhand) en geïncubeerd gedurende 1 minuut.
4. De gebrandschilderde RBC werden gewassen 5 maal met PBS.

Muis Voorbereiding

1. Drie tot zes maanden oude mannelijke C57BL/10 muizen werden gebruikt in deze studie. We verdoofde muizen door intraperitoneale injectie van pentobarbital (50mg/kgBW).
2. Muizen werden vervolgens geïntubeerd met een 20-gage polyethyleen buis, mechanisch geventileerd en verwarmd bij 37 ° C op een vel Kapton verwarming aangesloten op een thermokoppel sensor en feedback temperatuurregelaar systeem.
3. De ventrale zijde van de nek was geschoren. De rechter en linker musculus sternocleidomastoideus spieren werden blootgesteld. De spieren werden ondersteund door een roestvrij stalen houder en superfused met steriele Krebs Ringer-oplossing.

Injectie

1. Stained RBC werden verwarmd bij 37 ° C, verdund met Krebs Ringer. 50ul van gekleurde RBC (hematocriet 12%) werd geïnjecteerd in muizen uit de penis ader.

In vivo Microscopische observatie van de skeletspieren

We volgden Jeff W. Lichtman 's methode met ^{een wijziging:}

1. Dieren werden geplaatst op een verwarmings-pad op de top van een met de hand gemaakte ijzeren fase van een Nikon Eclipse-800 microscoop. Water dompelen-objectieven werden gebruikt voor live epi-fluorescent observatie. We zagen PKH26 gebrandschilderde RBC stroomt de binnenkant van bloedvaten onder TL-licht van een kwiklamp. We primaire arteriolen, secundaire arteriolen, capillairen en aderen herkenbaar aan hun rode bloedcellen stromen richting en architecturen.
2. Een intensievere SIT Camera (Hamamatsu Photonics, C2400, Japan) en video-frame grabber werden geïnstalleerd om de lage-intensiteit signaal vast te leggen op het real-time video-tarief (30 frames per seconde). Beelden werden opgenomen op DVD als video-bestanden.

Spierstimulatie

1. Een elektrische puls werd gegenereerd met behulp van een Peripheral Nerve Stimulator (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Nieuw-Zeeland), en afgeleverd bij spier oppervlak via een gecoate RVS sonde. Een minus sonde eind werd geplaatst op het proximale deel van spier-en een plus einde werd geplaatst op het distale deel van de spier. Tetanus prikkels werden gegeven tegen het tarief van 50 Hz gedurende 5 seconden. De elektrische prikkels veroorzaakte geen directe myofiber schade aan de omgeving van contactoppervlak.

RBC flux analyse

1. Opgenomen DVD video-opnames werden overgebracht Video Savant image bestanden via framegrabber software (Video Savant, USA). Video-opnames werden beoordeeld in aangepaste snelheid om de individuele gekleurde RBC te visualiseren. RBC flux werd gemeten door het tellen van RBC, die vloog door middel van een gerichte primaire arteriole per minuut.

Discussion

Belangrijke techinical punten zijn als volgt: (1) onderhoud van de fysiologische status van het dier (ventilatie, pH van de perfusative oplossing, lichaamstemperatuur), (2) injectie volume van de gebrandschilderde RBC, en (3) de voorwaarden voor observatie (optimale lens selectie, fluorescentie-intensiteit). Mogelijke toekomstige toepassingen zijn als volgt: (a) combinatie met pharmacophysiological en / of moleculaire biologische interventies, (b) lange termijn observatie van de arterioveneuze / arteriolo-sclerose en neovascularisatie.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 dye		Sigma-Aldrich		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.