Summary
微小循環の観察のための新たな汎用性の高い方法が提示される。それは長期的な観察のため、およびpharmacophysiologicalまたは分子生物学的介入との組み合わせに適して考えられている。
Abstract
背景：画像処理のさまざまなモダリティが発明した後調節因子およびin vivo微小循環での詳細な生理機能は十分に明らかではない残っている。血流の多くの巨視的パラメータは流速を反映しながら、血流速度および赤血球（RBC）フラックスの変化は、顕微鏡観察で直線関係を保持しません。 RBC速度とRBCフラックス、RBCフラックスとプラズマ流の量、および顕微鏡観察の末梢組織での流量調節の時間的空間的異質性、使用して微小循環調節におけるより詳細な研究の必要条件のための科学的根拠との間の矛盾の報告がある生体顕微鏡。
方法：我々はマウスの胸骨乳様突起の筋の生体顕微鏡観察でのジェフリヒトマンの方法を変更した。マウスは麻酔、換気、および顕微鏡観察のためのPKH26L -蛍光標識赤血球を注入。
結果＆結論：蛍光標識された赤血球が検出さと広視野顕微鏡でも区別される。電気刺激による誘発筋収縮は、RBCフラックスの増加を誘発した。赤血球速度と毛細血管密度を含む他のパラメータの定量化が可能であった。マウスは、よく染色された赤血球は、顕微鏡観察、および電気刺激の注射を手術を容認。いいえ筋肉や血管の損傷は、提案手法は、比較的低侵襲と長期的な観測のために適していることを示唆し、観察されなかった。
Protocol
赤血球膜の染色
- マウス赤血球をヘパリンと同じマウス系統から修正されました。
- マウスRBCはPKH26色素（;赤色蛍光細胞リンカーキット、シグマ、米国567分の551 nmの）で染色した。
- RBCは、PBSで洗浄し、室温で5分間PKH26色素の2μmの溶液とインキュベートした。反応は、プラズマを追加する（熱が65℃事前で1時間、不活化）と1分間インキュベートすることにより停止されました。
- ステンドRBCは、PBSで5回洗浄した。
マウスの準備
- 3〜6カ月齢の雄C57BL/10マウスは、本研究で使用した。我々はペントバルビタールの腹腔内注射（50mg/kgBW）で麻酔したマウス。
- マウスはその後、20ゲージのポリエチレンチューブを挿管人工呼吸器をつけ、そして37℃で加温した°で熱電対センサとフィードバックの温度制御システムに接続されているカプトンシートヒーターでC。
- 首の腹側を剃毛した。右と左胸骨乳様突起の筋肉が露出していた。筋肉は、ステンレス鋼製ホルダーでサポートされており、滅菌クレブスリンガー液で灌流した。
注射
- ステンド赤血球を37クレブスリンガーで希釈° C、で加温した。ステンドRBC（ヘマトクリット値12％）の50ULは、陰茎静脈からマウスに注射した。
骨格筋の生体顕微鏡観察で
我々は、変形例1でジェフW.リヒトマンの方法に従った。
- 動物は、ニコンのEclipse - 800顕微鏡の手作り鉄のステージの上に加熱パッド上に置いた。水浸対物レンズは、ライブ落射蛍光観察のために利用された。私たちは、水銀灯の蛍光灯の下で血管のPKH26ステンドRBC流れる内部を観察した。我々は彼らの赤血球の流れの方向とアーキテクチャによって一次細動脈、二次細動脈、毛細血管および静脈を同定した。
- 激化SITカメラ（浜松ホトニクス、C2400、日本）、ビデオフレームグラバーは、リアルタイムビデオレート（毎秒30フレーム）での低強度の信号をキャプチャするために設置されました。画像は、ビデオファイルとしてDVDに記録した。
筋刺激
- 電気パルスは、末梢神経刺激薬（Innervator 252、フィッシャー＆Paykelヘルスケア、ニュージーランド）を使用して生成し、コーティングされたステンレスプローブを介して筋肉の表面に配信されました。マイナスプローブ先端は、筋肉の近位部分に配置され、プラス端が筋の遠位部分に配置されました。破傷風の刺激は5秒間の50Hzの速度で投与した。電気刺激は、接触領域の近傍での直接の筋線維の損傷を誘発しなかった。
RBCフラックスの解析
- 記録されたDVDビデオの画像は、フレームグラバーのソフトウェア（ビデオサバント、米国）を介してビデオSavant社のイメージファイルを移した。ビデオイメージは個々のステンドRBCを視覚化するために調整された速度で検討された。 RBCフラックスは、毎分焦点を絞った一次細動脈を通して飛んだRBCを、数えることによって測定した。
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Discussion
重要なtechinicalな点は次のとおりです：観測（最適なレンズのための動物の生理状態の（1）メンテナンス（換気、perfusative溶液のpH、体温）、ステンドRBCの（2）注入量、および（3）の条件選択、蛍光強度）。潜在的な将来のアプリケーションは、次のとおりです。pharmacophysiologicalおよび/または分子生物学的介入と（a）の組み合わせ、動脈/細動脈 - 硬化症および血管新生の（b）の長期観測。
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Disclosures
動物実験に関連するすべての手順は、マサチューセッツ総合病院の研究動物のケアに関する小委員会によって審査され、承認された。
Acknowledgments
我々は、筋肉の生体観察での彼のアドバイスをJWリヒトマンに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
