Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

Summary

Um novo método versátil para a observação da microcirculação é apresentado. Ele é considerado adequado para observação a longo prazo, e para combinação com pharmacophysiological ou molecular intervenções biológicas.

Abstract

FUNDAMENTO: Os fatores de Regulamentação e fisiologia detalhada na microcirculação vivo permaneceram não totalmente esclarecido depois de muitas diferentes modalidades de imagem tinha inventado. Enquanto muitos parâmetros macroscópicos do fluxo de sangue refletem a velocidade de fluxo, as mudanças na velocidade do fluxo sanguíneo e de glóbulos vermelhos (RBC) de fluxo não mantém relação linear nas observações microscópicas. Há relatos de discrepância entre velocidade e fluxo RBC RBC, fluxo e volume de fluxo RBC plasma, e de heterogeneidade espacial e temporal da regulação do fluxo nos tecidos periféricos em observações microscópicas, uma base científica para a exigência de estudos mais detalhados na regulação da microcirculação usando microscopia intravital.

MÉTODOS: Foram modificados método de Jeff Lichtman de observação microscópica em vivo dos músculos esternomastoideu mouse. Os ratos são anestesiados, ventilados, e injetados com PKH26L-fluorescente hemácias marcadas para observação microscópica.

RESULTADO E CONCLUSÕES: hemácias fluorescente etiquetado são detectados e distinguidos bem por um microscópio de campo amplo. Contração muscular evocado pelo aumento da estimulação elétrica induzida em RBC fluxo. Quantificação de outros parâmetros, incluindo RBC velocidade ea densidade capilar foram viável. Camundongos bem tolerada a cirurgia, a injeção de hemácias marcadas, observação microscópica e estimulação elétrica. Nenhum músculo ou danos dos vasos sanguíneos foi observada, sugerindo que o nosso método é relativamente menos invasivo e adequado para observações a longo prazo.

Protocol

RBC coloração da membrana

1. Os glóbulos vermelhos do mouse foram corrigidos a partir da cepa do mouse mesmo com heparinização.
2. Rato RBC foram coradas com corante PKH26 (551/567 nm; kit linker Red fluorescentes das células, Sigma, EUA).
3. RBC foram lavados em PBS e incubadas com solução de 2μM PKH26 corante por 5 minutos em temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de plasma (inactivado pelo calor durante 1 hora a 65 ° C antes) e incubadas por 1 minuto.
4. A RBC manchadas foram lavadas 5 vezes com PBS.

Preparação do mouse

1. Três a seis meses, do sexo masculino C57BL/10 camundongos foram utilizados neste estudo. Nós ratos anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital (50mg/kgBW).
2. Camundongos foram, em seguida, intubados com um tubo de polietileno 20-gage, ventilação mecânica, e aquecido a 37 ° C em um aquecedor de folha de Kapton ligado a um sensor termopar e sistema de feedback controlador de temperatura.
3. O lado ventral do pescoço foi raspada. Os músculos direito e esquerdo esternomastoideu foram expostos. Os músculos foram apoiados por um suporte de aço inoxidável e com superfused estéril solução de Ringer Krebs.

Injeção

1. Hemácias coradas foram aquecidos a 37 ° C, diluído com Krebs Ringer. 50uL da RBC coradas (hematócrito 12%) foi injetado em rato da veia peniana.

Na observação microscópica vivo dos músculos esqueléticos

Seguimos Jeff W. Lichtman método 's com modificação ^1:

1. Animais foram colocados em uma almofada de aquecimento em cima de um palco de ferro hand-made de um microscópio Nikon Eclipse 800. Água-dipping lentes objetivas foram utilizados para a observação ao vivo epi-fluorescente. Observamos PKH26 dentro RBC manchada fluxo de vascular sob luz fluorescente de uma lâmpada de mercúrio. Identificamos arteríolas primário, secundário arteríolas, veias e capilares por suas direções de fluxo de hemácias e arquiteturas.
2. Uma Câmera SIT intensificou (Hamamatsu Photonics, C2400, Japão) e vídeo frame-grabber foram instalados para captação do sinal de baixa intensidade na taxa de vídeo em tempo real (30 frames por segundo). As imagens foram gravadas em DVD como arquivos de vídeo.

A estimulação muscular

1. Um pulso elétrico foi gerada utilizando um estimulador de nervo periférico (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Nova Zelândia), e entregue à superfície do músculo através de uma sonda revestida inoxidável. A extremidade da sonda menos foi colocada na parte proximal do músculo e um final mais foi colocada na parte distal do músculo. Estímulos tétano foram dados a uma taxa de 50Hz por 5 segundos. Os estímulos elétricos não causar danos musculares, direto na vizinhança da área de contato.

RBC análise de fluxo

1. Imagens de vídeo gravadas DVD foram transferidos ficheiros de imagem de vídeo através de software Savant quadro grabber (Vídeo Savant, EUA). Imagens de vídeo foram revistos em velocidade ajustada para visualizar individuais RBC manchado. RBC fluxo foi medida pela contagem RBC, que voou através de uma arteríola foco principal por minuto.

Discussion

Entre os principais pontos techinical são as seguintes: (1) manutenção do estado fisiológico do animal (pH ventilação, da temperatura do corpo perfusative solução,), (2) volume de injeção da RBC manchado, e (3) condições para a observação (lente ideal intensidade de seleção, a fluorescência). Potencial de aplicações futuras são as seguintes: (a) combinação com pharmacophysiological e / ou molecular intervenções biológicas, (b) a observação a longo prazo de arterio / arteriolo-esclerose e neovascularização.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 dye		Sigma-Aldrich		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.