Summary
Mikrodolaşımında gözlem için yeni bir çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bu uzun vadeli bir gözlem için uygun olduğu düşünülen ve pharmacophysiological veya moleküler biyolojik müdahaleler ile birlikte.
Abstract
AMAÇ: Düzenleyici faktörleri ve in vivo mikrosirkülasyon detaylı fizyolojisi kalmıştır tam görüntüleme icat eden pek çok farklı modaliteleri sonra açıkladı. Kan akımının birçok makroskopik parametreler akış hızı, kan akış hızı ve kırmızı kan hücre (RBC) değişiklikler yansıtırken akı mikroskobik gözlemler doğrusal bir ilişki tutmaz. RBC hız ve RBC akı, eritrosit akı ve plazma akışı hacmi arasında ve mikroskobik gözlemler, mikrosirkulasyonu yönetmelikte daha ayrıntılı çalışmalar gereksinimi için bilimsel bir temeli periferik dokularda akışını düzenleme mekansal ve zamansal heterojenliğin tutarsızlık raporları vardır intravital mikroskopi.
Yöntem: Biz in vivo fare sternomastoid kasların mikroskobik gözlem Jeff Lichtman yöntemi değiştirildi. Fareler anestezi, havalandırılmış ve mikroskobik gözlem PKH26L-floresan etiketli eritrositlerde enjekte.
SONUÇ & SONUÇLAR: floresan etiketli eritrositlerde algılanır ve çok geniş bir alan mikroskobu ile ayırt edilirler. RBC akı elektrik stimülasyonu bağlı artış ile uyarılmış kas kasılması. RBC hızı ve kapiller yoğunluğu da dahil olmak üzere diğer parametreleri Niceleme mümkün. Fare cerrahi, lekeli eritrosit enjeksiyonu, mikroskobik gözlem ve elektrik stimülasyonu iyi tolere edilir. Bizim yöntem, nispeten daha az invazif ve uzun vadeli gözlemler için uygundur olduğunu düşündüren herhangi bir kas veya kan damarı hasar gözlenmiştir.
Protocol
RBC membran boyanması
- Fare kırmızı kan hücreleri, heparin ile aynı fare suşu düzeltildi.
- Fare RBC PKH26 boya (Kırmızı floresan hücre ilintileyici kiti, Sigma, ABD 551/567 nm) ile boyandı.
- RBC PBS ile yıkandı ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PKH26 boya 2μM çözüm ile inkübe edildi. Tepki plazma ekleyerek (ısı 65 ° C önceden 1 saat süreyle inaktive) ve 1 dakika inkübe tarafından durduruldu.
- Lekeli RBC PBS ile 5 kez yıkandı.
Fare Hazırlık
- Bu çalışmada üç ila altı aylık bir erkek C57BL/10 fareler kullanıldı. Biz pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon (50mg/kgBW) tarafından anestezi farelerde.
- Fare, sonra 20-Gage polietilen tüp ile entübe mekanik ventilasyon ve 37 ° ısınmış ° C sıcaklık sensörü ve geri besleme sıcaklığı kontrol sistemi bağlı bir Kapton sac ısıtıcı.
- Boyun ventral tarafta traş oldu. Sağ ve sol sternomastoid kasları maruz bırakıldı. Kasları bir paslanmaz çelik sahibi tarafından desteklenen ve steril Krebs Ringer solüsyonu ile superfused.
Enjeksiyon
- Vitray eritrositlerde 37 ° C, Krebs Zil ile seyreltilmiş ısındı. Lekeli RBC (hematokrit% 12) 50ul penil ven fare enjekte edildi.
İskelet Kaslar in vivo Mikroskobik Gözlem
Biz modifikasyonu 1 ile Jeff W. Lichtman 'yöntemi takip etti:
- Hayvanlar Nikon Eclipse 800 mikroskop el yapımı demir sahne üstünde bir ısıtma yastığı yerleştirildi. Su daldırma objektif lens canlı epi-floresan gözlem için kullanılmıştır. Biz Mercury lamba floresan ışığı altında damar PKH26 lekeli RBC akan içinde gözlemledik. Biz onların eritrositlerde akış yönleri ve mimarileri, birincil arteriyollerin, ikincil arteriyoller, kılcal damarlar ve damarlar belirledi.
- Gerçek zamanlı video hızı (saniyede 30 kare), düşük yoğunluklu sinyal yakalamak için yoğun bir SİT Kamera (Photonics, C2400, Japonya) ve video frame grabber kuruldu. Görüntüler video dosyalarını DVD kaydedildi.
Kas Uyarım
- Periferik Sinir Stimulator (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Yeni Zelanda) bir elektrik sinyali kullanılarak oluşturulan ve kas yüzeyi kaplı paslanmaz prob ile teslim edildi. Proksimal kas parçası üzerinde eksi bir sonda yerleştirildi ve bir artı ucu kasının distal parçası yerleştirildi. Tetanoz uyarılara 5 saniye süreyle 50 Hz hızında verildi. Elektrik uyaranlara doğrudan temas alanının çevresinde myofiber hasara neden olmadı.
RBC akı analizi
- Frame grabber yazılım (Video Savant, ABD) aracılığıyla kaydedilmiş DVD video görüntüleri Video Savant görüntü dosyaları transfer edildi. Video görüntüleri, bireysel lekeli RBC görselleştirmek için ayarlanan hız incelendi. RBC akı dakikada odaklanmış bir birincil arteriyol üzerinden uçtu RBC, sayma ile ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önemli Teknik Özellikleri noktalar şunlardır: (1) gözlem için hayvanın fizyolojik durumu (havalandırma perfusative çözüm, vücut ısısı, pH), (2) enjeksiyon hacmi lekeli RBC, ve (3) koşulları bakım (en uygun lens seçimi, floresan). Potansiyel gelecekteki uygulamalar şunlardır: (a) pharmacophysiological ve / veya moleküler biyolojik müdahaleler ile kombinasyonu, (b) arterio / arteriolo-skleroz ve neovaskülarizasyon uzun vadeli bir gözlem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hayvan deneyleri ile ilgili tüm işlemler, Massachusetts Genel Hastanesi Araştırma Hayvan Bakım Alt Komitesi tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır.
Acknowledgments
Biz kasların in vivo gözlem onun tavsiye JW Lichtman teşekkür ederim.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
