在体内微循环在骨骼肌内重要的显微镜测量

Summary

提出一种新的微循环观察通用的方法。它被认为是适合长期观察，并结合pharmacophysiological或分子生物学干预。

Abstract

背景：监管因素和体内微循环的详细生理仍然没有完全澄清后成像发明了许多不同的方式。虽然许多宏观参数的血流量反映流速，血流速度和血红细胞（RBC）的变化通量不持有在显微镜观察的线性关系。有报告的差异之间的红细胞流速和红细胞通量，红细胞磁通和血浆流量，并在显微镜下观察，一个更详细的研究在微循环调节的要求的科学依据，使用的外围组织的时空异质性的流量调节活体显微镜。

方法：我们在显微镜下观察体内鼠标胸锁乳突肌肌肉修改杰夫李奇曼的方法。小鼠麻醉后，通风，并注射PKH26L -荧光标记的红细胞显微镜观察。

结果与结论：荧光标记的红细胞是由宽视场显微镜检测和区分。电刺激诱导的红细胞通量增加肌肉的收缩诱发。包括红细胞流速和毛细血管密度其它参数的量化是可行的。小鼠的耐受性以及手术，注射染色红细胞，显微镜下观察，和电刺激。没有肌肉或血管损伤，这表明我们的方法是侵入性和长期观察，比较适合。

Protocol

RBC膜染色

1. 与肝素相同的小鼠品系小鼠红细胞纠正。
2. 小鼠红细胞染色PKH26染料（五百六十七分之五百五十一nm的红色荧光细胞连接器套件，美国Sigma公司）。
3. 在PBS洗涤红细胞和2μm的溶液在室温下5分钟的PKH26染料孵育。反应是停止通过增加血浆（热灭活1小时在65℃事前）和孵育1分钟。
4. 染色用PBS洗涤红细胞的5倍。

鼠标的制备

1. 在这项研究中分别用三至6个月岁的男性C57BL/10小鼠。我们戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠（50mg/kgBW）。
2. 小鼠，然后用20 - GAGE​​聚乙烯管插管，机械通气，并在37回暖°连接热电偶传感器和反馈温度控制器系统加热器上的Kapton表
3. 颈部腹侧被剃光。左，右胸锁乳突肌肌肉暴露。由不锈钢持有人的肌肉得到了支持，并用无菌克雷布斯林格液灌流。

注塑

1. 彩绘红细胞升温37℃，与克雷布斯林格氏液稀释。 50ul染色RBC（红细胞压积12％）是从阴茎静脉注入小鼠。

在体内骨骼肌的显微观察

我们与修改¹杰夫李奇曼的方法^：

1. 动物被放置在一个尼康的Eclipse - 800显微镜手工制作的铁阶段上的一个加热垫。倾水的物镜，利用生活外延荧光观察。我们汞灯荧光灯下观察PKH26染色红细胞的血管流淌内。我们确定的主要动脉，二级动脉，毛细血管和静脉，其红细胞的流动方向和架构。
2. 加强薛相机（日本滨松光子学，C2400，日本）和视频图像采集卡安装在实时视频速率（每秒30帧）捕捉低强度信号。图像记录在DVD视频文件。

肌肉刺激

1. 使用外周神经刺激（Innervator 252，费雪派克医疗保健，新西兰）产生一个电脉冲，并通过肌肉表面涂层的不锈钢探头。 A减去探头末端放在近端的肌肉部分，加年底被置于远端的肌肉部分。破伤风的刺激，在5秒的速率为50Hz。电刺激，没有造成直接的肌纤维损伤附近的接触面积。

RBC通量分析

1. 录制的DVD视频图像传输视频SAVANT图像文件，通过图像采集卡软件（视频的学者，美国）。为了形象化个人染色红细胞的视频图像进行了审查，调整速度。通量测定红细胞计数红细胞，通过有重点的主要动脉，每分钟飞行。

Discussion

重要技术资料的要点如下：（1）观察维护动物的生理状况（通风，pH值perfusative解决方案，体温），（2）染色红细胞的注射量，（3）条件（最佳镜头选择，荧光强度）。未来潜在的应用如下：（一）结合pharmacophysiological和/或分子生物学干预措施，（二）长期观察动脉硬化/ arteriolo硬化和新生血管。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 dye		Sigma-Aldrich		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.