In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

Summary

Eine neue vielseitige Methode zur Beobachtung der Mikrozirkulation wird vorgestellt. Es gilt als geeignet für eine langfristige Beobachtung und für die Kombination mit pharmacophysiological oder molekularbiologische Eingriffe.

Abstract

HINTERGRUND: regulatorische Faktoren und detaillierte Physiologie der In-vivo-Mikrozirkulation geblieben nicht in vollem Umfang nach vielen verschiedenen Modalitäten der Bildgebung erfunden geklärt. Während viele makroskopischer Parameter des Blutflusses Strömungsgeschwindigkeit, Änderungen in der Geschwindigkeit des Blutflusses und der roten Blutkörperchen (RBC) spiegeln Fluss nicht halten lineare Beziehung in die mikroskopischen Beobachtungen. Es gibt Berichte über Diskrepanz zwischen RBC Geschwindigkeit und RBC flux, flux RBC und Plasma-Volumenstrom und der räumlichen und zeitlichen Heterogenität der Durchflussregelung in den peripheren Geweben in mikroskopischen Beobachtungen, eine wissenschaftliche Grundlage für die Anforderung von detaillierteren Studien in der Mikrozirkulation der Verordnung über Intravitalmikroskopie.

Methoden: Wir modifizierten Jeff Lichtman Methode der in vivo mikroskopische Beobachtung der Maus Kopfnicker Muskeln. Mäuse sind betäubt, belüftet, und injiziert mit PKH26L-fluoreszenzmarkierten Erythrozyten zur mikroskopischen Beobachtung.

ERGEBNIS & FAZIT: Fluoreszenz-markierte Erythrozyten werden erkannt und auch durch eine breite-Mikroskop aus. Muskelkontraktion durch elektrische Stimulation induzierte Zunahme RBC Flusses hervorgerufen. Quantifizierung von anderen Parametern, einschließlich RBC Geschwindigkeit und Kapillardichte möglich waren. Mäuse gut vertragen die Operation, Injektion von gefärbten roten Blutkörperchen, mikroskopische Beobachtung und elektrischer Stimulation. Kein Muskel-oder Blutgefäß beschädigt wurde beobachtet, was darauf hindeutet, dass unsere Methode relativ weniger invasive und geeignet für Langzeit-Beobachtungen ist.

Protocol

RBC Membranfärbung

1. Maus roten Blutkörperchen wurden aus dem gleichen Mausstamm mit Heparinisierung korrigiert.
2. Maus RBC wurden mit PKH26 Farbstoff (; Rot fluoreszierende Zelle Linker Kit, Sigma, USA 551/567 nm) gefärbt.
3. RBC wurden in PBS gewaschen und mit 2 um Lösung des PKH26 Farbstoff für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Plasma (Hitze für 1 Stunde bei 65 ° C vorher inaktiviert) und für 1 Minute gestoppt.
4. Die Kirchenfenster RBC wurden 5 mal mit PBS gewaschen.

Maus Vorbereitung

1. Drei bis sechs Monate alten männlichen C57BL/10 Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Wir narkotisierten Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50mg/kgBW).
2. Die Mäuse wurden dann mit einem 20-gage Polyethylen-Rohr intubiert beatmeten und erwärmt auf 37 ° C auf einem Blatt Kapton Heizer verbunden mit einem Thermoelement-Sensor und Feedback Temperaturregler System.
3. Die ventrale Seite des Halses wurde rasiert. Die rechten und linken M. sternocleidomastoideus Muskeln ausgesetzt waren. Die Muskeln wurden durch eine Edelstahl-Halterung unterstützt und superfundiert mit steriler Krebs-Ringer-Lösung.

Injektion

1. Stained Erythrozyten wurden bei 37 ° C, mit Krebs-Ringer verdünnt erwärmt. 50ul von Kirchenfenstern RBC (Hämatokrit 12%) wurde in der Maus aus dem Penis injiziert.

In vivo mikroskopische Beobachtung der Skelettmuskulatur

Wir folgten Jeff W. Lichtman 's Methode mit der Modifikation ^1:

1. Die Tiere wurden auf einem Heizkissen auf einem handgefertigten Eisen Stufe eines Nikon Eclipse-800-Mikroskop gelegt. Wasser-Eintauchen Objektive wurden für die Live-epi-Fluoreszenz-Beobachtung eingesetzt. Wir beobachteten PKH26 gebeizt RBC fließt im Inneren der Gefäße unter fluoreszierendem Licht einer Quecksilber-Lampe. Wir identifizierten primären Arteriolen, sekundäre Arteriolen, Kapillaren und Venen durch ihre RBCs Fließrichtungen und Architekturen.
2. Eine verstärkte SIT-Kamera (Hamamatsu Photonics, C2400, Japan) und Video-Frame Grabber installiert wurden, um die low-intensity-Signal an der Echtzeit-Video-Rate (30 Bilder pro Sekunde) zu erfassen. Die Bilder wurden auf DVD als Video-Dateien aufgezeichnet.

Muskelstimulation

1. Ein elektrischer Impuls wurde mit Hilfe eines peripheren Nerven Stimulator (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, New Zealand), und an Muskel-Oberfläche über eine beschichtete Edelstahl-Sonde. A minus Sonde Ende wurde am proximalen Teil des Muskels platziert und ein Plus-Ende wurde am distalen Teil des Muskels platziert. Tetanus Reize wurden mit einer Rate von 50 Hz für 5 Sekunden. Die elektrischen Impulse nicht die Ursache für direkte myofiber Schäden an der Umgebung der Kontaktfläche.

RBC Stoffflussanalyse

1. DVD-Video Bilder wurden Video Savant Bilddateien über Framegrabber-Software (Video Savant, USA) übertragen. Video Bilder wurden in eingestellten Geschwindigkeit überprüft werden, um einzelne Flecken RBC visualisieren. RBC Fluss wurde durch Zählen RBC, die durch eine gezielte primäre Arteriole pro Minute flog gemessen.

Discussion

Wichtige techinical Punkte sind wie folgt: (1) Wartung der physiologische Zustand des Tieres (Lüftung, pH-Wert der Lösung perfusative, Körpertemperatur), (2) Injektionsvolumen des gefärbten RBC, und (3) Bedingungen für die Beobachtung (optimale Linse Auswahl-, Fluoreszenz-Intensität). Mögliche zukünftige Anwendungen sind wie folgt: (a) Kombination mit pharmacophysiological und / oder molekularbiologische Eingriffe, (b) langfristige Beobachtung der arterio / arteriolo-Sklerose und Gefäßneubildung.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 dye		Sigma-Aldrich		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.