Summary
Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.
Abstract
Antecedentes: Los factores de regulación y de la fisiología detallada de la microcirculación in vivo se han mantenido no totalmente aclarado después de muchos diferentes modalidades de imagen se había inventado. Si bien muchos parámetros macroscópicos del flujo sanguíneo refleja la velocidad de flujo, los cambios en la velocidad del flujo sanguíneo y de glóbulos rojos (RBC) de flujo no se mantiene una relación lineal en las observaciones microscópicas. Hay informes de discrepancia entre la velocidad y el flujo de RBC RBC, el flujo de glóbulos rojos y el volumen de plasma de flujo y de la heterogeneidad espacial y temporal de regulación de flujo en los tejidos periféricos, en las observaciones microscópicas, una base científica para la exigencia de estudios más detallados en la regulación de la microcirculación con microscopía intravital.
MÉTODOS: Se modificó el método de Jeff Lichtman en la observación microscópica in vivo de los músculos esternocleidomastoideo ratón. Los ratones son anestesiados, ventilados, y se inyecta con PKH26L-fluorescencia glóbulos rojos marcados para la observación microscópica.
RESULTADO Y CONCLUSIONES: Los glóbulos rojos marcadas fluorescentemente se detectan y se distingue también por un microscopio de campo amplio. La contracción muscular provocada por aumento de la estimulación eléctrica inducida en el flujo de RBC. La cuantificación de otros parámetros como la velocidad de glóbulos rojos y la densidad capilar eran factibles. Los ratones toleraron bien la cirugía, la inyección de glóbulos rojos manchados, la observación microscópica, y la estimulación eléctrica. No hay daños en músculos y los vasos sanguíneos se observó, lo que sugiere que nuestro método es relativamente menos invasivo y adecuado para observaciones a largo plazo.
Protocol
RBC tinción de membrana
- Ratón las células rojas de la sangre se han corregido de la misma cepa de ratón con heparinización.
- Ratón RBC fueron teñidas con tinte PKH26 (551/567 nm, rojo fluorescente kit enlazador celular, Sigma, EE.UU.).
- RBC se lavaron en PBS y se incubaron con una solución de 2μM PKH26 colorante durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de plasma (inactivado por calor durante 1 hora a 65 ° C antes) y se incubó durante 1 minuto.
- El manchado RBC se lavaron 5 veces con PBS.
Preparación del ratón
- De tres a seis meses de edad, masculino C57BL/10 ratones fueron usados en este estudio. Nos ratones anestesiados por inyección intraperitoneal de pentobarbital (50mg/kgBW).
- Los ratones fueron entonces intubado con un tubo de polietileno de 20 calibre, con asistencia respiratoria mecánica, y se calienta a 37 ° C en un calentador de hoja de Kapton conectado a un sensor de termopar y el sistema de retroalimentación controlador de temperatura.
- La parte ventral del cuello se afeitó. Los músculos esternocleidomastoideo derecho e izquierdo fueron expuestos. Los músculos fueron apoyados por un soporte de acero inoxidable y superfusión con Krebs Ringer estéril.
Inyección
- Los glóbulos rojos teñidos se calienta a 37 ° C, se diluye con Krebs Ringer. 50 ul de manchas RBC (hematocrito 12%) se inyectó en ratones de la vena del pene.
En la Observación microscópica in vivo de los músculos esqueléticos
Hemos seguido el método Jeff W. Lichtman 's con la modificación de uno:
- Los animales fueron colocados en una almohadilla térmica en la parte superior de una etapa de hierro hecha a mano de una Nikon Eclipse 800 microscopio. Inmersión en agua lentes del objetivo se utilizaron para vivir epi-fluorescente de observación. Hemos observado PKH26 manchado el interior que fluye de RBC vascular bajo una luz fluorescente de una lámpara de mercurio. Se identificaron las arteriolas primaria, secundaria arteriolas, capilares y venas de sus direcciones de flujo de los glóbulos rojos y arquitecturas.
- Una cámara de SIT intensificado (Hamamatsu Photonics, C2400, Japón) y capturador de video-marco se instalaron para captar la señal de baja intensidad en la velocidad de vídeo en tiempo real (30 imágenes por segundo). Las imágenes fueron grabadas en DVD como archivos de vídeo.
La estimulación muscular
- Un impulso eléctrico se ha generado mediante un estimulador de nervio periférico (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Nueva Zelanda), y entregado a la superficie del músculo a través de una sonda de acero recubierto. Un extremo de la sonda menos fue colocado en la parte proximal del músculo y un final más fue colocada en la parte distal del músculo. Estímulos tétanos se les dio a razón de 50 Hz durante 5 segundos. Los estímulos eléctricos no causó daño miofibrilar directo en las inmediaciones del área de contacto.
RBC flujo de análisis
- Las imágenes grabadas de vídeo DVD fueron transferidos los archivos de imágenes de vídeo a través de Savant software capturador de marco (Video Savant, EE.UU.). Las imágenes de vídeo se revisaron en la velocidad ajustada con el fin de visualizar cada manchada RBC. RBC flujo se mide contando RBC, que voló a través de una arteriola centrado primaria por minuto.
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Discussion
Importantes puntos TÉCNICAS son las siguientes: (1) mantenimiento del estado fisiológico del animal (ventilación, el pH de la solución de la temperatura corporal perfusative,), (2) el volumen de inyección de los glóbulos rojos manchados, y las condiciones (3) para la observación (óptima del lente selección, la intensidad de fluorescencia). Las posibles aplicaciones futuras son las siguientes: (a) junto con las intervenciones biológicas pharmacophysiological y / o molecular, (b) observación a largo plazo de la arterio / arteriolo esclerosis y neovascularización.
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Disclosures
Todos los procedimientos relacionados con los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Subcomité de Investigación en Atención Animal Hospital General de Massachusetts.
Acknowledgments
Damos las gracias a JW Lichtman por su asesoramiento en materia de observación en vivo de los músculos.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 dye | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit | ||
| C57BL/10 mice | Animal | Three to six month old males | ||
| pentobarbital | anesthetic, 50mg/kgBW, i.p. |
References
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
