Summary
Мы показываем здесь, что эпигенетические перепрограммирования через пересадки ядра соматической клетки (SCNT) может быть использован как инструмент для создания моделей мышей с заранее определенными рецепторами Т-клеток (TCR) особенностей. Эти transnuclear мышей выразить соответствующее TCR от их национального локуса под контролем эндогенных промоутера.
Abstract
Лимфоциты, таких как Т-клетки, пройти генетическое V (D) J рекомбинация, генерировать рецептор с определенной спецификой 1. Трансгенных мышей для переставить антиген-специфические Т-клеток рецептор (TCR) были незаменимым инструментом для изучения развития науки и функционирование клеток. Однако такие ТКО, как правило, изолированы от соответствующих Т-клетки после длительного культура часто после неоднократных антигена стимуляции, что неизбежно выбирает для Т-клеток с высоким сродством. Случайные геномной интеграции TCR α-и β-цепи и выражения, не являющихся эндогенными промоутеров может привести к изменению уровня экспрессии и кинетики.
Эпигенетическая перепрограммирования соматических клеток с помощью переноса ядра предоставляет инструмент для создания эмбриональных стволовых клеток мышей и от любой ячейке интерес. Следовательно, при SCNT применяется для Т-клеток, известной спецификой, эти генетические V (D) J перестановки передаются SCNT-эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши и производные от них, в то время как эпигенетические маркеры сбрасываются. Мы показали, что Т-клетки с заранее определенными особенностями против Toxoplasma гондий может быть использован для создания моделей мышей, которые выражают конкретные TCR от эндогенных локусов, без экспериментально введен генетической модификации. Относительная легкость и скорость, с которой такие transnuclear модели могут быть получены перспективен для строительства других моделей болезни.
Protocol
Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Kirak и соавт., Наука 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Выделение донорских клеток
Перед специфических Т или В-клеток может быть использована в качестве донорских клеток для создания transnuclear модели мыши, мыши должны быть инфицированы возбудителем интереса или иммунизированных антигеном интересов. Так как мы использовали CD8 + клетки, специфические для Toxoplasma гондий, следующий протокол будет описывать поколения и изоляции этих клеток и нуждается в адаптации в соответствии с личными интересами.
- Кисты основе гомогената мозга мыши (около 40) вводят внутрибрюшинно в BL / 6 х Balb / с F1 (B6CF1) мыши, что позволяет изоляции как H-2 б и Н-2 г ограничено CD8 + Т-клеток.
- На пике иммунного ответа, инфицированные мыши эвтаназии, селезенки изолированы и помещены в блюдо с 6 мл эритроцитов (RBC) лизис буфера.
- Использование матовой стороны двух слайдов покрова, селезенки тщательно землю и инкубировали в буфере лизиса в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить 14 мл PBS, фильтры клеточной суспензии через ячейки сетчатого фильтра (40 или 70 мкм) в 50 мл сокола трубки и центрифуги в течение 5 минут при температуре 300 гр.
- Удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл PBS и передачи в 1,5 мл трубки Эппендорф. Центрифуга течение 5 минут при 300 и удалить супернатант после этого.
- Ресуспендируют осадок клеток в 50 мкл PBS, добавьте флуоресцентно меченых антител для определения типа клеток, представляющие интерес (например, CD3, B220, CD8 и CD4) и флуоресцентно меченных MHC-I тетрамер (MHC-II тетрамера для CD4 Т-клеток), загружаемые с пептидом, представляющим интерес для клеточной суспензии и инкубировать 30 мин при 4 ° C.
- Добавьте 1 мл PBS, центрифуги в течение 5 мин при 300 г, ресуспендируют осадок в 3 мл PBS, и фильтр клеточной суспензии через ячейки сетчатого фильтра (40 или 70 мкм) в трубке.
- Выполните FACSorting установкой ворот строго (рис. 1В).
2. Переноса ядер соматических клеток
Есть несколько протоколов для переноса ядер соматических клеток. Описанному здесь используется ооцитов арестован в Метафаза-II и торможение второго деления мейоза использованием цитохалазином B. Поэтому донорских клеток необходимы, которые находятся в фазе G0/G1.
- Подготовка ооцитов
- Женский мышей BDF1 фоном вводят внутрибрюшинно с 5IU PMS на мышь между 5 вечера и 7 вечера.
- Около 47 часов спустя, каждая мышь вводили внутрибрюшинно с 5IU HCG.
- Подготовка культуры блюдо (KSOM-АА капель под масло) для ооцитов в тот же день, как инъекции HCG и поместить их в инкубатор 37 ° C, 5% СО 2. Кроме того, подготовить необходимые для игл SCNT (7 мкм для энуклеации и 4 или 5 мкм для переноса ядра лимфоцитов ядер), загрузив их с ртутью.
- Усыпить мышей и изолировать яйцеводы о 13h после ХГЧ (около 8 утра). Сбор яйцеводов через 1-2 капель HCZB.
- Один за одним двигаться яйцеводы в каплю содержащие М2 ж / Гиалуронидаза. Ник яйцевода аккуратно forcep и двигаться ооцит-кучевые-комплекса в капли. В конце концов ооцит-кучевые-комплексы были выделены, блюдо инкубировали при 37 ° C.
- После 2-5 минут (точное время зависит от партии Гиалуронидаза) сбора ооцитов, умойся в HCZB и пластины их в KSOM-АА капель.
- Энуклеация ооцитов
- Используйте крышку чашки Петри для подготовки SCNT пластины. Настройка микроскопа и микроманипулятора.
- Вымойте энуклеации иглы (7 мкм) в ПВП, прежде чем начать с энуклеации.
- Для энуклеации, место группы ооцитов (10-30) в капле HZCB с цитохалазин (5 мкг / мл). Хотя инкубации (не менее 5 мин) состав ооцитов горизонтально.
- Принимать по одной яйцеклетки и поместить его в передней части проведения иглы. Fix ооцитов для проведения иглы с применением вакуума. Использование энуклеации иглу, поверните яйцеклетки до хромосом шпиндель-комплекс (CSC, который часто называют «ядром») находится в 3-часовой отметке.
- Использование пьезоэлектрических импульс проникает зона pellucida осторожно, не повреждая яйцеклетки. Место открытия иглы, прилегающих к Метафаза-II шпиндель и применять вакуум. "Ядра" должны медленно двигаться в иглу, и мембрана должна сама печать, когда он будет полностью удален.
- Передача энуклеированных ооцитов обратно в KSOM-АА капли, и мыть их несколько раз. Повторите электроннойнуклеации шаги новой группы яйцеклеток. Продолжайте, пока все яйца энуклеированных или примерно до 11 утра.
- Ядерная передача
- Для переноса ядра, обмен энуклеации иглой (7 мкм) с ядерной иглы передачи (4 или 5 мкм) и промойте его PVP.
- Наведите клетки интерес (например, CD8 + Т-клеток) в капли с PVP, хорошо перемешать и выдержать в течение минимум 10 мин.
- Место группы извлекли ядра ооцитов (10-30) в капле HCZB с цитохалазин (2,5 мкг / мл). Хотя инкубации (не менее 5 мин) состав ооцитов горизонтально, ориентируясь по ядерной иглы передачи.
- Возьмите донорских клеток из ПВП-клеточной суспензии и аспирации ее в-и-вне, пока наружной мембраны сломался (фрагменты мембраны и цитоплазмы должны быть видны). При необходимости пьезо-импульса может быть применен. Как только ядро был изолирован, переместите его немного в иглу, и продолжайте поднимать ядер пока у вас есть 10-30.
- Переход на падение содержащие выровнены энуклеированных ооцитов. Зафиксируем одну яйцеклетку для проведения иглы с применением вакуума. Место ядерной иглы передачи (ядра должны быть вдали от открытия), прилегающих к Zona pellucida и применять пьезо-импульса, пока игла прошла через зона pellucida. Тщательно перемещать одного ядра к кончике иглы, нажмите иглу в яйцеклетку, пока кончик иглы составляет 2 / 3 внутри. Нанесите небольшое отрицательное давление, так что немного ооцитов мембраны в иглу.
- Следующим шагом является очень критичным, так как это единственное время, когда яйцеклетка на самом деле "открытый". Применение одиночного импульса пьезо, нажмите ядра из иглы, применяя положительное давление, осторожно вытяните назад иглу так, чтобы кончик составляет около 1 / 3 в яйцеклетку, а затем применить отрицательное давление и продолжают тянуть назад иглы печать яйцеклетки. Повторите этот шаг с каждой яйцеклетки.
- Ведь ооциты группы получили ядра, их промывают и культивируют в KSOM-АА СМИ. Повторите эту процедуру со всеми ооцитов.
- После последней группы был культур в KSOM-АА в течение минимум 30 мин, SCNT-эмбрионы переносятся в капель Ca-бесплатной активации сред, содержащих SrCl2.
- После 6 часов активации, количество псевдо-пронуклеусы (ППН)-положительные SCNT-эмбрионов определяется. Эмбрионов затем промывали и культивировали в KSOM-АА капли для еще 3,5 дней, пока они не достигнут стадии бластоцисты.
- Наркотики или химических веществ выбора (например, Trichostatin) могут быть добавлены к активации и питательных сред.
3.Derivation эмбриональных стволовых клеток
SCNT-бластоцисты может быть использована для передачи их в псевдо-беременных самок (также известный как прямое или один шаг клонирования), либо для получения эмбриональных стволовых клеток (также известный как косвенные или двухступенчатый клонирование). Так как она является гораздо более эффективным для создания ЭС клетки, мы выбираем два этапа. В случае ученый заинтересован в прямом клонирование, бластоцисты могут быть переданы непосредственно в псевдо-беременных самок, как описано в разделе 5.
Есть много протоколов описания вывод эмбриональных стволовых клеток. Описанному здесь стандартная техника, которая использует фидерных клеток, и фетальной телячьей сыворотки.
- На второй день после переноса ядра, готовить 96-U-луночного планшета для вывода ячейки ES.
- Добавить 100 мкл желатин в каждую лунку по 96-U-луночного планшета, инкубировать в течение минимум 10 минут, и удалить его после этого.
- Оттепель фидерных клеток и ресуспендируют в соответствии объем ОУР среды, например фидерные клетки эквивалентно площади 25 см 2 ресуспендируют в 10 мл ОУР средних и 200 мкл клеточной суспензии добавляют в каждую из желатина, обращались хорошо.
- Положите пластину в инкубаторе и культуры при 37 ° C, 5% СО 2.
- Через 3,5 суток, эмбрионы должны быть на стадии бластоцисты.
- Подготовка стерильного бактериальных блюдо при посеве Несколько капель ES средой клетки и кислой thyrode.
- Бластоцист сначала передается от KSOM-АА капель в капли, содержащие нормальные среда ячейки ES и промывают дважды.
- Тщательно передачи группу бластоцист (5-10 бластоцист) в одной капле кислого thyrode и держать там, пока зона pellucida не растворится.
- Бластоцист затем переносятся в каплю со средним Е.С., дважды промывают, а затем помещается в устройство подачи покрытием 96-U-луночного планшета (один бластоцисты в одну лунку).
- Эмбрионов затем культивировали в течение 5-7 дней в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2, не нарушая их. Это дает эмбриона времяttach для фидерного слоя, и сформировать результат.
- Подготовка 24-луночных планшетах, при посеве фидеров в ОУР среды в каждую лунку, например ресуспендирования эквивалента 50 см 2 подачи в 12 мл ОУР среды, и добавьте 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку.
- Осторожно снимите ОУР среды от 96-U-луночный планшет с эмбрионами, мыть каждую лунку в два раза с 250 мкл Hepes (или PBS), добавить 50 мкл трипсина и инкубировать в течение 5 минут при температуре 37 ° C.
- Внесите вверх и вниз несколько раз, пока результат распалась в одной клеточной суспензии, перевод на 24-луночного планшета и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО 2.
- Если ESC вывод был успешным, ESC колониях должны быть видны через 7-10 дней.
4.Blastocyst инъекции
Инъекция бластоцист является рутинной техникой для создания любых трансгенных мышах. Важно отметить, что инъекции бластоцисты и последующей передачи в псевдо-беременных женщин должна быть приурочена хорошо.
- Премьер самок мышей с ПМС и HCG, как описано в разделе 2.1. После инъекции HCG положить самок мышей вместе с самцов мышей (одна женщина и один мужчина мыши в клетке).
- На следующий день, проверять женщин для зажигания. Это считается как 0.5dpc (дней после полового акта).
- Оплодотворенные эмбрионы затем выделяют из яйцевода, как описано в разделе 2.1, и культивировали в KSOM-АА дополнительные 3 дня.
- Подготовка ЭС клеток в день бластоцисты инъекций (3.5dpc).
- Удаление среды из ЭС клетки, мыть дважды Hepes (или PBS), добавьте трипсина и инкубировать 5 минут при температуре 37 ° C.
- Ресуспендируют трипсином клетки с ES среды, пластины в блюдо, и выдержать в течение 45-60 минут при температуре 37 ° C, 5% СО 2, чтобы уменьшить количество фидерных клеток (фидерных клеток придерживаться быстрее, чем стволовые клетки).
- Передача клеточной суспензии через ячейки сетчатого фильтра (40 или 70 мкм) в трубе, и центрифуги в течение 5 мин при 1000rpm.
- Удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл среды ES и хранить на льду, пока это необходимо.
- Подготовка крышку стерильной бактериальных блюдо при посеве капель, содержащих ПВП и HCZB.
- Подготовка 15 мкм иглы путем загрузки с ртутью, поместив его в должность и стирки с ПВП.
- Место группы бластоцист (10-30 бластоцист) в капли с HCZB, и добавьте 5-50 мкл суспензии клеток ES (в зависимости от концентрации) в другую каплю HCZB.
- Возьмите ЭС клетки (50-100 клеток) с инъекционной иглой.
- Переместить в капли с бластоцисты. Совместите бластоцист по горизонтали, и исправить один с проведением иглы с применением вакуума.
- Использование инъекционной иглой свою очередь бластоцисты до внутренней клеточной массы (ICM) находится на 9-часовой отметке.
- Наведите инъекционной иглой в 3 часа, убедитесь, что Есть нет ЭС клеток на кончике иглы, и применять пьезо-импульса до инъекции игла проникает через зона pellucida и трофэктодермы в бластоцель.
- Выпуск нескольких ЭС клетки (5-15 клеток), так что ЭС клетки придерживаться ICM. Продолжайте, пока все бластоцист из группы были вводили стволовые клетки.
- После одной группе бластоцист закончен, мыть их дважды в KSOM-АА и держать их в капли с KSOM-АА, пока все бластоцист вводят.
5. Эмбрион Трансфер
Перенос эмбрионов в псевдо-беременных женщин представляет хирургическая процедура, которая должна осуществляться очень осторожно и в соответствии с руководящими принципами института исследователя.
- Анестезировать самок мышей получателя, бриться правом нижнем квадранте, и дезинфекции.
- Использование ножницы открытым кожи, так и отдельные брюшины от кожи.
- Найдите яичников через брюшину (красное пятно), и открытые брюшины в непосредственной близости от яичника.
- Использование щипцов, тщательно захватить яйцевода и вытащить матку.
- Встреча группы около 10 бластоцист с капиллярной подключен к рот пипеткой.
- Fix матки с одной щипцы, удар небольшой целого на его небольшую иглу и вставьте капилляр с бластоцист в полость матки.
- Тщательно релиз эмбрионов в матку, и удалить капилляра.
- Нажмите матку обратно в брюшную полость.
- Найдите края брюшины и закрыть его с несколькими стежками.
- Закрыть кожи мыши с несколькими скрепками.
- Для послеоперационной боли, администрировать 5 мкг Carprofen на мг массы тела.
Рисунок 1. Ядер соматических клетокпередачи заранее определенных Т-клеток в B6CF1 фоне. Абсолютное и относительное количество эмбрионов полученные от CD8 + Т-клетки и эмбриональные стволовые клетки основе SCNT бластоцисты.
Рисунок 2. Представителю проточной цитометрии химерных мышей вводили SCNT эмбриональных стволовых клеток. Ворота и номер (процентов общего CD8 + Т-клетки) указывает на наличие специфических CD8 + T-клеток в химерных мышей.
Discussion
Мы показали здесь, что SCNT может быть использован для создания transnuclear мышей от Т-клеток с заранее определенными специфику. Хотя это и не показано здесь, методика должна также использоваться для генерации transnuclear мышей из В-клеток с заранее определенными специфику.
Одна важная вещь, чтобы рассмотреть, является напряжение и пол мыши, которые заражены или иммунизацию и используется для изоляции Т или В-клеток, представляющих интерес. Поскольку Т и В-клетки имеют очень низкую эффективность перепрограммирования в целом, мы рекомендуем использовать гибридов F1 желаемого гаплотип. Потому что клетки-донора и определяет пол, мы рекомендуем использовать Т или В-клеток от мышей-самцов. Это означает, что только мужчины, химерных мышей передаст TCR или BCR через зародышевой линии, с самцов мышей быть проще и быстрее размножаться.
Взятые вместе, мы считаем, что эпигенетические перепрограммирования через SCNT представляет собой мощный инструмент для создания нового типа мышь модели, которые будут иметь большое преимущество для иммунологических области.
Disclosures
Патент была подана.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность А. Эйзен, М. Gubbels, К. ван Grinsven, Е. Гильен, А. Дрейк, В. Махаджан, В. Гао, и Г. Yap для плодотворных дискуссий и реагентов. Мы благодарны Дж. Dausman, Р. Фланнери и Дж. Джексон за помощью в управление мышью колонии. Мы благодарны П. Вишневский для FACSorting. EMF было поддержано правам Программа научно-технических границ. RJ было поддержано Национальным институтом здравоохранения грантов RO1-HD045022 и R37-CA084198. HLP была поддержана грантами от Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
- Schatz, D. G. V(D)J recombination. Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
- Eggan, K. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).
- Kishigami, S. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).
