Biology

从Midgastrula舞台果蝇胚胎神经文化的制备

Published: July 4, 2007 doi: 10.3791/226

¹Department of Development and Cell Biology, Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

这个视频演示midgastrula阶段果蝇胚胎的主要神经文化的准备。生活文化的意见表明电镀和后2天在碳酸氢盐为基础的定义中等的增长有区别的神经元细胞1小时后。神经元电兴奋，并形成突触连接。

Abstract

该视频演示了midgastrula阶段果蝇胚胎的主要神经文化的过程。收集胚胎和dechorionation使用漂白水的方法证明。我们说明了一嘴吸痰管使用玻璃吸管，从单一胚胎细胞清除。分散成小（5升）下降中等未涂层的玻璃盖玻片上的每一个embyro细胞的方法是证明。一个电镀后1小时，通过显微镜说明首选的细胞密度。大多数细胞的生存时，在定义中等增长是神经母细胞分裂前12-24小时延长神经炎进程的一个或多个次文化。通过显微镜说明突起生长的水平，预计在2天的体外分支在一个健康的文化。的文化是生长在一个简单的碳酸氢钠为主的定义介质在_5％二氧化碳培养箱中培养，在22-24 ° C。神经炎进程继续阐述文化的第一个星期，当他们从邻近的细胞，他们往往形成功能性突触连接的突起联系。在这些文化中的神经元表达电压门控钠，钙，钾通道，电兴奋。这种文化系统是用于研究分子遗传和环境因素，调节神经细胞的分化，兴奋性突触的形成/功能。

Protocol

一，果蝇胚胎收集

准备鸡蛋收集板
1. 煮沸200毫升与8克琼脂DH _{2 O}
2. 冷却至50 ° C
3. 加入2 ml乙醇和2毫升乙酸
4. 倒入35 mm塑料培养皿中，上衣
5. 酷存储在密封容器中，并在4 ° C
6. 使大约80板
准备酵母膏
1. 溶解于水Fleishmans积极烘烤酵母的形式粘贴
2. 20-30秒杀死酵母微波（小心沸腾了）
3. 商店在10 CC（无针头注射器，在4 ° C的2个星期）
苍蝇：用于鸡蛋收集的成年人通常是最有生产力的后3至14天之间出现，提供他们已经获得新鲜食品。许多突变的股票有生育能力，可以体现在降低了产蛋和改变他们是最有生产力的年龄，率下降。一般情况下，数百名成人为一个良好的产蛋人口。
程序：一个鸡蛋收集板的粘贴，传播一层薄薄的酵母。这提供了一个有利的基板铺设鸡蛋。转移成蝇一个干净的鸡蛋收集瓶和磁带的收集板瓶口。不要离开苍蝇在这些瓶子超过3-4小时，湿度上升和苍蝇得到停留在粘贴和一瓶双方。

二。使用漂白剂的胚胎Dechorionation

设置连接到一个连接到一个吸引器的滤瓶一个布氏漏斗。在漏斗放一块的Whatman＃1纸。吸运行，湿纸用无菌蒸馏水。
到同一个流从洗瓶水冲洗滤纸收集板的胚胎。
几卷的无菌水冲洗，关闭吸引器，然后添加50％的漂白粉漏斗量。让鸡蛋坐5-10分钟。 chorions会被溶解在1-2分钟，但你离开的时间越长在漂白剂的胚胎将被销毁的污染酵母。挑出任何成人或幼虫冲洗掉菜。
的无菌培养皿中（而不是组织文化）用无菌蒸馏水冲洗胚胎。在胚胎中的许多人会坚持底部的菜，如果它没有被预湿。这个菜无菌水冲洗数次。
与透射光下检查胚胎挑出中期原肠期胚胎。

三。制备单胚胎培养

请DDM1（见第四节食谱）
倒掉水菜的胚胎前夕培养。封面用无菌媒体的胚胎。
3，35 mm培养皿。在4轮蒸压盖玻片，在每一道菜。在每个盖玻片，放5μL介质。使用Bellco盖玻片低铅玻璃coverlips。

Bellco生物玻璃器皿
800-257-7043
CAT＃1943-00012
拉一些相当精细的吸管。我们使用的吸管被拉到一个Narishige PP - 83拉马。吸管的确切尺寸并不重要，我们通常拉他们比我们想的更细，他们打破了在相同的视野提示胚胎的大小来衡量。你不想吸了一口气所有的胚胎，你不想针尖那么小，它需要5分钟吸细胞。瞄准介于两者之间。与透射光下检查胚胎，使用口吸气管连接到吸管去除胚胎的内容。分散轻轻驱逐细胞尽可能靠近盖玻片准备盖玻片上的细胞。您可能要检查的盖玻片，在更高的功率，并进一步在以同样的方式驱散的细胞。
让细胞不超过10分钟，坐。与媒体和洪水的菜放在培养箱中培养，4-5％的CO ₂环境中，如果使用定义介质。温度介于22-24 ° C。我们经常使用的是23℃，湿度95％。湿度是重要的，只要你想，以避免蒸发。您可以使用放置在冷库温度控制标准的哺乳动物的孵化器设定至23 ° C。

四。 DDM1不断增长的文化定义介质

设为DMEM培养液：100 MLS火腿的F12/DME媒体（DMEM）（＃9052）欧文分校的科学。
1. 新增的0.476克羟乙基（20MM）（西格玛＃H - 3375）。混合。
2. 添加1.25毫升L -谷氨酰胺200毫米（尔湾科学＃9317）。混合。
3. 在0.2微米醋酸注射器过滤器（需要2个过滤器）过滤罩。
4. pH值是6.64和OSM 288。
5. 15ml离心管分装为10ml。
6. 储存于4 ° C下不超过2周。
  
  注意：请务必使用蒸压过滤水，并在媒体和辅料只保留容器。永远不要把pH电极或搅拌Media.To其他用途使用的栏：下面列出的DDM1添加补充以DMEM培养液之前来培养。
10毫升的DMEM中添加：
- 100μL转
- 100μL腐胺
- 100μL硒
- 100μL孕酮
- 50μL胰岛素

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Discussion

在果蝇的文化准备midgastrula阶段的胚胎的神经元产生的，其中许多鸿沟之前，在体外分化成神经细胞前体。因此，该系统提供了一个独特的机会，在神经元发育的早期阶段（Rohrbaugh等，2003）中的重要探索遗传和环境因素。我们已经表明，生长在一个简单的定义介质的神经元分化成神经元电兴奋，也形成功能性突触连接（直径多德，1995年李和O多德，1999年）。使用分析突变体和/或药理操作，在这个模型系统可用于探索参与电兴奋性突触传递（霍奇斯等，2002年的发展作用的基因和环境因素的技术与标准的全细胞记录相结合;李Ø多德，2000年Lee等人，2003年）。

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Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS27501 DKOD支持。这从霍华德休斯医学研究所教授格兰特DKOD工作的额外支持。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.