Summary
这个视频演示midgastrula阶段果蝇胚胎的主要神经文化的准备。生活文化的意见表明电镀和后2天在碳酸氢盐为基础的定义中等的增长有区别的神经元细胞1小时后。神经元电兴奋,并形成突触连接。
Abstract
该视频演示了midgastrula阶段果蝇胚胎的主要神经文化的过程。收集胚胎和dechorionation使用漂白水的方法证明。我们说明了一嘴吸痰管使用玻璃吸管,从单一胚胎细胞清除。分散成小(5升)下降中等未涂层的玻璃盖玻片上的每一个embyro细胞的方法是证明。一个电镀后1小时,通过显微镜说明首选的细胞密度。大多数细胞的生存时,在定义中等增长是神经母细胞分裂前12-24小时延长神经炎进程的一个或多个次文化。通过显微镜说明突起生长的水平,预计在2天的体外分支在一个健康的文化。的文化是生长在一个简单的碳酸氢钠为主的定义介质在5%二氧化碳培养箱中培养,在22-24 ° C。神经炎进程继续阐述文化的第一个星期,当他们从邻近的细胞,他们往往形成功能性突触连接的突起联系。在这些文化中的神经元表达电压门控钠,钙,钾通道,电兴奋。这种文化系统是用于研究分子遗传和环境因素,调节神经细胞的分化,兴奋性突触的形成/功能。
Protocol
一,果蝇胚胎收集
- 准备鸡蛋收集板
- 煮沸200毫升与8克琼脂DH 2 O
- 冷却至50 ° C
- 加入2 ml乙醇和2毫升乙酸
- 倒入35 mm塑料培养皿中,上衣
- 酷存储在密封容器中,并在4 ° C
- 使大约80板
- 准备酵母膏
- 溶解于水Fleishmans积极烘烤酵母的形式粘贴
- 20-30秒杀死酵母微波(小心沸腾了)
- 商店在10 CC(无针头注射器,在4 ° C的2个星期)
- 苍蝇:用于鸡蛋收集的成年人通常是最有生产力的后3至14天之间出现,提供他们已经获得新鲜食品。许多突变的股票有生育能力,可以体现在降低了产蛋和改变他们是最有生产力的年龄,率下降。一般情况下,数百名成人为一个良好的产蛋人口。
- 程序:一个鸡蛋收集板的粘贴,传播一层薄薄的酵母。这提供了一个有利的基板铺设鸡蛋。转移成蝇一个干净的鸡蛋收集瓶和磁带的收集板瓶口。不要离开苍蝇在这些瓶子超过3-4小时,湿度上升和苍蝇得到停留在粘贴和一瓶双方。
二。使用漂白剂的胚胎Dechorionation
- 设置连接到一个连接到一个吸引器的滤瓶一个布氏漏斗。在漏斗放一块的Whatman#1纸。吸运行,湿纸用无菌蒸馏水。
- 到同一个流从洗瓶水冲洗滤纸收集板的胚胎。
- 几卷的无菌水冲洗,关闭吸引器,然后添加50%的漂白粉漏斗量。让鸡蛋坐5-10分钟。 chorions会被溶解在1-2分钟,但你离开的时间越长在漂白剂的胚胎将被销毁的污染酵母。挑出任何成人或幼虫冲洗掉菜。
- 的无菌培养皿中(而不是组织文化)用无菌蒸馏水冲洗胚胎。在胚胎中的许多人会坚持底部的菜,如果它没有被预湿。这个菜无菌水冲洗数次。
- 与透射光下检查胚胎挑出中期原肠期胚胎。
三。制备单胚胎培养
- 请DDM1(见第四节食谱)
- 倒掉水菜的胚胎前夕培养。封面用无菌媒体的胚胎。
- 3,35 mm培养皿。在4轮蒸压盖玻片,在每一道菜。在每个盖玻片,放5μL介质。使用Bellco盖玻片低铅玻璃coverlips。
Bellco生物玻璃器皿
800-257-7043
CAT#1943-00012 - 拉一些相当精细的吸管。我们使用的吸管被拉到一个Narishige PP - 83拉马。吸管的确切尺寸并不重要,我们通常拉他们比我们想的更细,他们打破了在相同的视野提示胚胎的大小来衡量。你不想吸了一口气所有的胚胎,你不想针尖那么小,它需要5分钟吸细胞。瞄准介于两者之间。与透射光下检查胚胎,使用口吸气管连接到吸管去除胚胎的内容。分散轻轻驱逐细胞尽可能靠近盖玻片准备盖玻片上的细胞。您可能要检查的盖玻片,在更高的功率,并进一步在以同样的方式驱散的细胞。
- 让细胞不超过10分钟,坐。与媒体和洪水的菜放在培养箱中培养,4-5%的CO 2环境中,如果使用定义介质。温度介于22-24 ° C。我们经常使用的是23℃,湿度95%。湿度是重要的,只要你想,以避免蒸发。您可以使用放置在冷库温度控制标准的哺乳动物的孵化器设定至23 ° C。
四。 DDM1不断增长的文化定义介质
- 设为DMEM培养液:100 MLS火腿的F12/DME媒体(DMEM)(#9052)欧文分校的科学。
- 新增的0.476克羟乙基(20MM)(西格玛#H - 3375)。混合。
- 添加1.25毫升L -谷氨酰胺200毫米(尔湾科学#9317)。混合。
- 在0.2微米醋酸注射器过滤器(需要2个过滤器)过滤罩。
- pH值是6.64和OSM 288。
- 15ml离心管分装为10ml。
- 储存于4 ° C下不超过2周。
注意:请务必使用蒸压过滤水,并在媒体和辅料只保留容器。永远不要把pH电极或搅拌Media.To其他用途使用的栏:下面列出的DDM1添加补充以DMEM培养液之前来培养。
- 10毫升的DMEM中添加:
- 100μL转
- 100μL腐胺
- 100μL硒
- 100μL孕酮
- 50μL胰岛素
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Discussion
在果蝇的文化准备midgastrula阶段的胚胎的神经元产生的,其中许多鸿沟之前,在体外分化成神经细胞前体。因此,该系统提供了一个独特的机会,在神经元发育的早期阶段(Rohrbaugh等,2003)中的重要探索遗传和环境因素。我们已经表明,生长在一个简单的定义介质的神经元分化成神经元电兴奋,也形成功能性突触连接(直径多德,1995年李和O多德,1999年)。使用分析突变体和/或药理操作,在这个模型系统可用于探索参与电兴奋性突触传递(霍奇斯等,2002年的发展作用的基因和环境因素的技术与标准的全细胞记录相结合;李Ø多德,2000年Lee等人,2003年)。
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Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS27501 DKOD支持。这从霍华德休斯医学研究所教授格兰特DKOD工作的额外支持。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
Transferrin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
Petri dishes | ||||
Cover-slips | Bellco Glass | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
Paper filter | Whatman, GE Healthcare | #1 | ||
10cc syringe | Tool | |||
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media. |
References
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).