Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones d'embryons de drosophile midgastrula scène. Vues des cultures vivantes montrent les cellules 1 heure après le placage et les neurones différenciés après 2 jours de croissance dans un milieu à base de bicarbonate défini. Les neurones sont électriquement excitables et forment des connexions synaptiques.
Cette vidéo illustre la procédure de mise cultures neuronales primaires d'embryons de drosophile midgastrula scène. Les méthodes de collecte des embryons et leur dechorionation utilisant l'eau de Javel sont démontrés. Aide d'une pipette en verre attaché à un tube d'aspiration bouche, nous illustrons l'élimination de toutes les cellules issues d'embryons unique. La méthode pour disperser les cellules d'embryons de chaque dans un petit (5 l) goutte de milieu sur une lamelle de verre sans revêtement est démontrée. Une vue à travers le microscope à 1 heure après le placage illustre la densité de cellule préférée. La plupart des cellules qui survivent lorsqu'elles sont cultivées en milieu défini sont neuroblastes qui divisent une ou plusieurs fois dans la culture avant d'étendre les processus neuritique par 12-24 heures. Une vue à travers le microscope illustre le niveau de la croissance des neurites et la ramification attendus dans une culture saine à 2 jours in vitro. Les cultures sont cultivées dans un milieu à base de bicarbonate de simples définis, dans un 5% de CO 2 incubateur à 22-24 ° C. Processus neuritiques continuer à élaborer au cours de la première semaine de la culture et quand ils entrent en contact avec des neurites des cellules voisines, ils forment souvent des connexions synaptiques fonctionnelles. Les neurones de ces cultures d'exprimer voltage-dépendants sodium, le calcium, et les canaux potassiques et sont électriquement excitables. Ce système de culture est utile pour étudier moléculaires des facteurs génétiques et environnementaux qui régulent la différenciation neuronale, excitabilité et la formation des synapses / fonction.
Dans les cultures préparées à partir de la drosophile embryons au stade midgastrula les neurones proviennent de précurseurs neuroblastes, dont beaucoup divisent avant de différenciation in vitro. Ce système offre donc une occasion unique d'étudier les facteurs génétiques et environnementaux importants dans des phases très précoces du développement neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nous avons montré que les neurones cultivés dans un milieu simple défini différencier en neurones électriquement excitables qui a également…
Ce travail a été soutenu par le NIH aux subventions NS27501 DKOD. Un appui supplémentaire pour ce travail à partir d'une subvention HHMI professeur d'DKOD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
Petri dishes | ||||
Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
Paper filter | Whatman | #1 | ||
10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.