Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Zellen 1 Stunde nach dem Ausplattieren und differenzierten Neuronen nach 2 Tagen Wachstum in einem Bicarbonat-basierten definiertem Medium. Die Neuronen sind elektrisch erregbar und bilden synaptische Verbindungen.
Dieses Video zeigt das Verfahren zur Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Die Methoden für die Erhebung Embryonen und ihre dechorionation mit Bleichmittel demonstriert. Mit einer Glaspipette an einem Mund-Saugrohr, illustrieren wir die Entfernung aller Zellen, die aus einzelnen Embryonen. Das Verfahren zum Dispergieren Zellen aus jeder embyro in einen kleinen (5 l) Tropfen Medium auf einer unbeschichteten Deckglas wird demonstriert. Ein Blick durch das Mikroskop bei 1 Stunde nach dem Ausplattieren zeigt die bevorzugte Zelldichte. Die meisten der Zellen, wenn in definierten Medium überleben Neuroblasten, dass ein oder mehrere Male in der Kultur teilen, bevor Erweiterung neuritischen Prozesse durch 12-24 Stunden. Ein Blick durch das Mikroskop zeigt den Grad der Neuritenwachstum und Verzweigung in eine gesunde Kultur in 2 Tage in vitro zu erwarten. Die Kulturen werden in einer einfachen Bicarbonat Basis definiert Medium, in einer 5% CO 2-Inkubator bei 22-24 ° C. Neuritischen Prozesse weiter zu erarbeiten über die erste Woche in der Kultur, und wenn sie in Kontakt mit Neuriten aus dem benachbarten Zellen bilden sie oft funktionelle synaptische Verbindungen. Neuronen in diesen Kulturen auszudrücken spannungsabhängigen Natrium, Kalzium und Kalium-Kanälen und sind elektrisch erregbar. Diese Kultur ist nützlich für die Untersuchung molekularer genetischen und umweltbedingten Faktoren, die neuronale Differenzierung, Erregbarkeit und Synapsenbildung / Funktion zu regulieren.
In Drosophila Kulturen aus midgastrula Embryonen bereitete den Neuronen entstehen aus Neuroblasten Vorläufer, von denen viele vor der Differenzierung in vitro zu teilen. Dieses System bietet somit eine einmalige Gelegenheit für die Exploration von genetischen und umweltbedingten Faktoren wichtig in sehr frühen Phasen der neuronalen Entwicklung (Rohrbaugh et al., 2003). Wir haben gezeigt, dass Neurone in einer einfachen Definition-Medium in elektrisch erregbaren Neuronen, bilden auch funktionelle synaptische Verbindungen (O Dowd, 1995; Le…
Diese Arbeit wurde vom NIH NS27501 zu DKOD unterstützt. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeiten von einem HHMI Professor Grant zu DKOD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
Petri dishes | ||||
Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
Paper filter | Whatman | #1 | ||
10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.