Summary
قمنا بتطوير برنامج كمبيوتر لتحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية. في تركيبة مع اثنين من القائمة أدوات التحليل مفتوحة المصدر ، برنامجنا ينفذ تحليل Sholl ويحدد عدد neurites ، نقطة تفرع ، ونصائح neurite. يتم إجراء التحاليل بحيث يمكن ملاحظة التغيرات المحلية في التشكل neurite.
Abstract
مورفولوجيا الخلايا العصبية تلعب دورا هاما في تحديد كيفية وظيفة الخلايا العصبية والتواصل 1-3. على وجه التحديد ، فإنه يؤثر على قدرة الخلايا العصبية لتلقي مدخلات من الخلايا الأخرى (2) ويسهم في انتشار إمكانات العمل 4،5. ومورفولوجية neurites يؤثر أيضا على كيفية معالجة المعلومات. تنوع morphologies تغصن تسهيل الإشارات المحلية والبعيدة المدى والسماح الخلايا العصبية الفردية أو مجموعات من الخلايا العصبية للقيام بالمهام المتخصصة داخل الشبكة العصبية 6،7. وقد لوحظت تغييرات في التشكل تغصن ، بما في ذلك تفتيت التشعبات والتغيرات في أنماط المتفرعة ، في عدد من الحالات المرضية ، بما في ذلك مرض الزهايمر 8 ، 9،10 الفصام والتخلف العقلي 11. القدرة على فهم كل من العوامل التي تشكل morphologies تغصن وتحديد التغيرات في morphologies تغصن أساسي في فهم وظيفة الجهاز العصبي وخلل وظيفي.
ويتم تحليل كثير من الأحيان عن طريق تحليل مورفولوجيا Neurite Sholl وحساب عدد neurites وعدد من النصائح فرع. يتم تطبيق هذا التحليل عموما على التشعبات ، ولكن يمكن أيضا أن يطبق على المحاور. أداء هذا التحليل على حد سواء باليد تستغرق وقتا طويلا ويدخل حتما تقلب بسبب تحيز المجرب والتضارب. برنامج موقد هو نهج شبه الآلي لتحليل وتغصن محواري مورفولوجيا أن يبني المتاحة المصدر المفتوح أدوات التحليل الصرفي. برنامجنا تمكن من الكشف عن التغيرات المحلية في تغصن ومحوار المتفرعة عن طريق إجراء تحليل السلوكيات Sholl على الشجرة الفرعية للالتهاب الأعصاب. على سبيل المثال ، يتم تنفيذ Sholl التحليل على الخلايا العصبية على حد سواء ككل وكذلك على كل جزئية من العمليات (الابتدائي والثانوي والمحطة ، وجذر ، الخ) ويتأثر تغصن والزخرفة محور عصبي من جانب عدد من العوامل داخل وخارج الخلايا ، وكثير يتصرف محليا. وبالتالي ، فإن الناتج هو جذع التشكل نتيجة لعمليات محددة بناء على neurites محددة ، مما يجعل من الضروري إجراء تحليل الصرفي على نطاق أصغر من أجل مراعاة هذه الاختلافات المحلية 12.
برنامج مشعلة يتطلب استخدام اثنين من أدوات التحليل مفتوح المصدر ، البرنامج المساعد لNeuronJ ImageJ وNeuronStudio. وتتبع الخلايا العصبية في ImageJ ، ويستخدم لتحديد NeuronStudio الربط بين neurites. الشعلة يحتوي على عدد من النصوص المكتوبة في العرف MATLAB (MathWorks) التي تستخدم لتحويل البيانات إلى الشكل المناسب لمزيد من التحليل ، والتحقق من المستخدم للأخطاء ، وإجراء تحليل Sholl في نهاية المطاف. أخيرا ، يتم تصدير البيانات إلى Excel للتحليل الإحصائي. ويبين الرسم البياني للبرنامج مشعلة في الشكل 1.
Protocol
1. قبل أن تبدأ :
1) تشريح الفئران E18 :
طرق تشريح معيار E18 الخلايا العصبية الحصين قد سبق ووصف 13. من أجل استخدام البرنامج مشعلة لتحليل الخصائص المورفولوجية للneurites ، يجب الحصول على 8 بت. TIF صور من الخلايا العصبية الفردية. ويمكن تحقيق ذلك في عدد من الطرق اعتمادا على بروتوكول التجريبية كنت التالية. يمكن مطلي الخلايا العصبية في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية بحيث تظهر الخلايا العصبية واحدة في مجال المجهر. بدلا من ذلك ، الخلايا العصبية الصور الفردية التي تزرع في ثقافة كثيفة ، ويمكن استخدام الخلايا العصبية transfected مجموعة متنوعة من أساليب الترميز ترنسفكأيشن مع البلازميد بروتين فلوري.
متطلبات البرامج 2) والتثبيت :
- يجب على كل من المساعد للبرنامج NeuronJ ImageJ من المعاهد الوطنية للصحة وNeuronStudio يتم تثبيتها في النظام لتشغيل البرنامج مشعلة. يمكن العثور على حزم البرمجيات في المواقع التالية :
ImageJ -- http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ -- http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio -- http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - ويمكن الاطلاع على البرنامج في موقد http://lifesci.rutgers.edu/ firestein ~. دليل المستخدم موقد هو أيضا متوفرة في هذا الموقع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على وصف الأولي في موقد انغهامر وآخرون ، 2010 الخلوي. وقد تم تحليل جميع البيانات المتوفرة لدينا باستخدام نظام التشغيل Windows.
3) ضبط دقة الصورة :
سوف تحتاج إلى تعديل برنامج مشعلة على أساس القرار صورة من الصور التي ترغب في تحليلها. في جزء من برنامج bonfire_parameters مشعلة ، يستعاض عن القيمة الحالية للpix_conv متغير مع قيمة دقة الصورة (ميكرون / بكسل) من الصور الخاصة بك.
2. ملف الهيكل التنظيمي :
من أجل مشعلة لتحليل البيانات الخاصة بك ، يجب أن يتم تنظيم الملفات الموجودة في هذا الهيكل محددة (الشكل 2). سيكون لديك :
- والمجلد الرئيسي
- مجلدات فرعية (التي تحتوي على كل من شروطكم مختلفة)
- ملفات الصور الخلية (ملفات filename.tif) الواردة في المجلدات حالة مختلفة
- مجلد يحتوي على موقد نار مطلب mfiles (الوارد أيضا في المجلد الرئيسي)
3. تعقب الخلايا العصبية في NeuronJ :
- تعد صورة لتعقب
- فتح الصورة عن طريق اختيار 'فتح' زر في شريط الأدوات NeuronJ واختيار الصورة التي ترغب في تتبع.
- تغيير حجم الصورة عن طريق اختيار 'تعظيم' زر.
- ضبط السطوع والتباين في الصورة بحيث يمكنك رؤية كل من neurites عن طريق تحديد "صورة" على شريط الأدوات ثم تحديد NeuronJ "ضبط السطوع / التباين.
- تتبع خلايا الجسم في NeuronJ وتحديد التتبع بأنها "نوع 06'
- حدد الزر "إضافة آثار' على شريط الأدوات NeuronJ.
- تتبع حول محيط خلايا الجسم.
- حدد زر 'الإقتفاء تسمية" على شريط الأدوات NeuronJ.
- حدد "N1' من 'للبحث عن المفقودين معرف' القائمة المنسدلة.
- حدد "نوع 06" في NeuronJ : سمات النافذة وحدد "موافق".
- تتبع neurites في NeuronJ
- حدد الزر "إضافة آثار' على شريط الأدوات NeuronJ.
- إضافة تتبع طول كل فرع neurite. يمكنك فقط تحديد التشعبات أو محور عصبي ، واعتمادا على التجربة الخاصة بك.
- نقترح أن قطاعات ترسمه تتوقف عند كل نقطة تفرع ، مع كل نقطة فرع ابنة بدءا من هذه النقطة باعتبارها تتبع جديد.
- اختر زر "حفظ الإقتفاء" على شريط الأدوات NeuronJ.
- حفظ تتبع قمت بإنشائها فقط في نفس المجلد مثل ملف الصورة الأصلية.
- تصدير ملفات التتبع وملف التتبع المعرف من NeuronJ
يجب أن يتم تصدير نوعين من الملفات من NeuronJ وحفظها في المجلدات المناسبة شرط جنبا إلى جنب مع. TIF والملفات الجبهة.- اختر زر "تتبع التصدير" على شريط الأدوات NeuronJ.
- حدد "المفصول deliminated النص الملفات : ملف منفصل عن" الخيار على كل منهما تتبع NeuronJ : تصدير "مربع الحوار وحدد" موافق ".
- NeuronJ تسمح لاختيار أسماء الملفات وحفظها في الموقع.
- حدد زر 'الإقتفاء قس' على شريط الأدوات NeuronJ.
- حدد خيار "عرض تتبع القياسات' على 'NeuronJ : قياسات" النافذة واختر "تشغيل".
- حدد "ملف" في "NeuronJ : الإقتفاء« النافذة.
- حدد "حفظ باسم" وحفظ الملف ك filename_info. يجب أن 'اسم' تتطابق تماما مع اسم ملف الصورة الأصلية (بما في ذلك رأس المال) ، يليه _Info وينبغي ألا تحتوي على 3 أحرف ملف التمديد. على سبيل المثال ، صورة Cell20.tif اسم الأصلي ، سيكون هذا الملف المسمى "Cell20_info. تأكد من أن جهاز الكمبيوتر الخاص بك لا يقوم تلقائيا بإضافة ملحق ملف. XLS. اذا ، لا بد من تمديد الملف المحذوف يدويا.
4. استخدام موقد لإنشاء ملفات البيانات الأولية الصادرة عن SWC NeuronJ :
- اعادة تنظيم المجلدات باستخدام "bonfire_load'
- مطلب فتح بواسطة النقر المزدوج على أيقونة.
- انقر على زر 'في الجزء العلوي الأيمن من إطار الأوامر.
- حدد "موقد" مجلد في المجلد الرئيسي الخاص بك في "استعراض للمجلد« النافذة.
- نوع 'bonfire_load" في إطار الأوامر مطلب ودخول الصحافة.
- حدد المجلد شرط ان كنت ترغب في تحليل في "استعراض للمجلد« النافذة وحدد "موافق".
- وهذا إعادة تنظيم بنية مجلد عن طريق إنشاء خلية مجلدات فرعية تحتوي على كافة البيانات عن كل خلية على حدة.
- إنشاء ملفات filename_prelim.swc باستخدام 'bonfire_ndf2swc'
- 'bonfire_ndf2swc' نوع في إطار الأوامر واضغط ENTER.
- حدد المجلد نفس الحالة كنت للتو مع تنظيم "bonfire_load" في سياق "استعراض للمجلد« النافذة وحدد "موافق".
- وهذا إنشاء ملف. SWC في كل مجلد خلية للشرط الذي تم اختياره. سيكون كل مجلد يحتوي على خلية الآن 5 ملفات ؛ الأصلي صورة TIF ، ملف الجبهة ، المعرف تتبع ملف _Info ، ملف TXT وملف SWC.....
5. استخدام ملفات NeuronStudio لوضع اللمسات الأخيرة SWC :
- فتح ومعايرة الصور الخلايا العصبية في NeuronStudio
- فتح البرنامج NeuronStudio.
- حدد ملف → فتح على شريط الأدوات NeuronStudio.
- العثور على صورة TIF. من الخلايا العصبية التي تريد تحريرها وفتحه.
- حدد تشغيل وأدخل إعدادات → '1' في كل من 3 (X ، Y ، Z) مربعات في "إطار الحجم فوكسل.
- حدد ملف → SWC استيراد. حدد الملف المناسب. SWC. الآن سوف يكون ملف الصورة مضافين مع صورة التتبع. وينبغي للمضافين سوما الخلية مع دائرة حمراء.
- لاستخدام NeuronStudio neurites الارتباط
- استخدام الأدوات في NeuronStudio لتحديد نقاط صحيح فرع ونقطة النهاية (من المستحسن أن التعرف عليك مع ميزات NeuronStudio واختصارات قبل تحليل البيانات).
- على وجه التحديد ، استخدم "أداة neurite للانضمام العقد بحيث :
- يمكن لكل فرع نقطة (العقد الصفراء) فقط إنشاء فرعين
- كل آثار والمستمر مع سوما (عقدة واحدة فقط حمراء)
- بيانات الصادرات من NeuronStudio
- حدد ملف → Neurites حفظ (حفظ كاسم الافتراضي).
- تحقق من وجود أخطاء في ملفات. SWC باستخدام 'bonfire_trace_check'
- 'bonfire_trace_check' نوع في إطار الأوامر Mathlab ودخول الصحافة.
- حدد المجلد الذي يحتوي على حالة البيانات التي قمت معالجتها فقط في "استعراض للمجلد« النافذة وحدد "موافق".
- إذا كانت هناك أية أخطاء في أي من الصور في مجلد البرنامج سوف يتم عرض إخراج الصور حيث يقع الخطأ.
- إصلاح الأخطاء في NeuronStudio
- فتح ملف الصورة التي قمت بحفظها في الخطوة المصدرة.
- تحديد المشكلة وإصلاحها (ق).
- انقر فوق ملف → حفظ Neurites.
- كرر لغيرها من الصور التي تحتاج إلى أن تكون ثابتة.
- أعد تشغيل "bonfire_trace_check' (5.4).
6. استخدام "الشعلة" لاستخراج البيانات من الملفات المورفولوجية SWC :
- 'الشعلة' نوع في إطار الأوامر واضغط ENTER.
- حدد المجلد الشرط الذي يحتوي على البيانات التي تريد تحليلها في "استعراض للمجلد« النافذة وحدد "موافق".
- سيتم تحليل مشعلة توليد نافذة لكل من الخلايا العصبية التي يجري تحليلها ، الذي الرسوم البيانية ومورفولوجيا الخلايا العصبية مع حلقات Sholl المستخدمة في التحليل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قيادة "الشعلة" إنشاء ملف. حصيرة الذي يحتوي على كافة المعلومات الشكلية التي اتخذت من التحليل.
7. استخدام 'bonfire_results' لعرض البيانات :
- نوع 'bonfire_results" في إطار الأوامر مطلب.
- حدد المجلد شرطا لحالة كنت ترغب في عرض في "استعراض للمجلد« النافذة وحدد "موافق".
- إرادة "تصفح للمجلد« النافذة تغلق مؤقتا وإعادة فتح ، مما يسمح لك لتحديد شروط إضافية ترغب في عرضها.
- عندما يتم الانتهاء من تحديد المجلدات الشرط ، حدد "إلغاء" للخروج من عملية الاختيار.
- 'Bonfire_results" سيعود ملخص بما في ذلك الرسوم البيانية عشربيانات البريد من المجلدات الشرط المحدد لك.
8. استخدام 'bonfire_export" لتصدير البيانات إلى Excel :
- نوع 'bonfire_export" في إطار الأوامر.
- حدد المجلد الذي يحتوي على بيانات الحالة التي ترغب في تصدير "تصفح للمجلد« النافذة وحدد "موافق". سوف Bonfire_export إنشاء ملفات Excel من البيانات والمورفولوجية ووضعها في مجلد حالة التي تم تحديدها.
9. ممثل النتائج :
ويرد مثال على البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج نار على مجموعة من البيانات التي تحتوي على شرطين في الشكل 3. في هذا المثال ، الحالة 1 الخلايا العصبية تحتوي على أكثر neurites القاصي إلى خلايا الجسم. ويمكن ملاحظة هذه الظاهرة في الصور على سبيل المثال (الشكل 3B) ، وكذلك في منحنى Sholl من جذع شجيري الكلي (الشكل 3A) وفي الرسم البياني لعدد من النقاط الطرفية (الشكل 3C). بالإضافة إلى ذلك ، لأن البرنامج ينفذ مشعلة أيضا على تحليل Sholl الفرعية من الصور ، ونحن قادرون على تحديد أكثر تحديدا هوية neurites التي زادت. كل من العدد الإجمالي للتقاطعات نظامية الثالثة 3 أو أكبر neurites الشكل (3F) والعدد الإجمالي لكل من وسيط وneurites محطة (الشكل 3G) هي زيادة القاصي إلى خلايا الجسم. ويمكن أيضا أن تكون هذه الاتجاهات التي لوحظت في الأرقام و3D 3E.
وتتبع الرسم البياني للبرنامج مشعلة الخلايا العصبية باستخدام ImageJ : الشكل 1. ثم يتم تصدير البيانات وتحويلها من قبل برنامج مشعلة في ملفات SWC الأولية. ويستخدم لتحديد NeuronStudio التواصل بين neurites. الشيكات الشعلة عن أخطاء ومن ثم يحسب منحنيات Sholl ، وعدد من التعليم الابتدائي ، neurites النظام الثانوي ، والعالي ، وعدد من النقاط ونصائح فرع neurite. أخيرا ، يتم تصدير البيانات إلى Excel للتحليل الإحصائي.
الشكل 2 : الهيكل ملف المطلوبة لتحليل بنية موقد يجب أن يطابق هذا الملف أو البرنامج لن تعمل بشكل صحيح. يمكن تغيير أسماء الملفات والمجلدات وكمية من المجلدات والملفات.
الشكل 3 : بيانات الناتج مثال من برنامج مشعلة A) منحنيات Sholl المجموع. B) مثال مقلوب صور كلا الشرطين. C) متوسط عدد من النقاط ونقاط فرع محطة / الخلية. D) متوسط عدد العمليات / الخلية لالابتدائي والثانوي والعالي neurites أو أكبر و. E) متوسط عدد العمليات / الخلية الجذرية ، وسيطة ، وneurites المحطة. F) هوية محددة قطعة منحنيات تحليل Sholl. كما يتم تجميع قطاعات التعليم الابتدائي والثانوي العالي ، أو ، أو أكبر. G) هوية محددة قطعة منحنيات تحليل Sholl. كما يتم تجميع شرائح شرائح الجذرية ، وشرائح وسيطة ، أو أجزاء المحطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البرنامج هو برنامج مشعلة شبه الآلي لتحليل تغصن ومورفولوجيا محور عصبي. لأنه يزيد كثيرا من كفاءة ودقة التحليل Sholl على أداء تحليل يدويا. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر برنامج مشعلة البيانات في كل خطوة من العملية ، مما يجعل من الممكن لتدقيق البيانات والتحقق من دقة التحليل. ولذلك ، يمكن توزيع مهمة لتحليل البيانات العديد من الأفراد دون المساس دقة. أخيرا ، عن طريق إجراء تحليل على المناطق الفرعية من الصور ، والبرنامج قادر على التعرف على التغيرات المحلية في المتفرعة التي غاب عند تشغيل Sholl التحليل فقط على تغصن بأكمله أو جذع محور عصبي. برنامجنا هو قادرا على تحديد كيفية ترتيب مجموعات فرعية محددة من neurites في اشارة الى خلايا الجسم. نتيجة لذلك ، هي أنماط المتفرعة في الصور جيدا ممثلة في البيانات التي يتم إنشاؤها بواسطة برنامج مشعلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المتنافسة. كانت وكالات التمويل أي دور العلمية في تطوير موقد.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المنحة الطبية بوسكه NSF ، منح IBN 0548543 - NSF ، منح بن 0919747 مارس من الدايمات مؤسسة المنح 1 - FY04 - 107 ، مارس من الدايمات مؤسسة المنح 1 - FY08 - 464 (لBLF). وقدم الدعم وMKK CGL بواسطة التكنولوجيا الحيوية NIH T32 المنح التدريبية GM008339 - 20 ، وكان مدعوما أيضا من قبل لجنة CGL نيوجيرسي على الحبل الشوكي زمالة أبحاث Predoctoral 08-2941 - SCR - E - 0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
