Summary
우리의 연결 형태를 분석하는 컴퓨터 프로그램을 개발했습니다. 두개의 기존 오픈 소스 분석 도구와 함께, 우리의 프로그램은 숄 분석을 수행하고 neurites, 지사 지점 및 neurite 팁의 수를 결정합니다. 분석은 neurite 형태의 지역 변화가 관찰 수 있도록 수행됩니다.
Abstract
의 연결 형태 뉴런은 기능과 1-3 의사 소통 방법을 결정하는 중요한 역할을합니다. 특히, 그것은 다른 세포로부터 입력을받을 수 뉴런의 기능에 영향을 미치는 2 4,5 행동 잠재력의 전파에 기여하고있다. neurites의 형태도 정보가 처리되는 방법에 영향을줍니다. dendrite morphologies의 다양성은 로컬 및 장거리 신호를 촉진하고 신경 개별 뉴런 또는 그룹의 연결을 네트워크 6,7 내에 전문적인 기능을 수행하실 수 있습니다. dendrites과 패턴을 분기의 변화 조각을 포함 dendrite 형태의 변경은, 알츠하이머 병 8, 정신 분열증 9,10, 그리고 정신 지체 11를 포함하여 질병 상태의 숫자에서 관찰되었습니다. 두 dendrite morphologies을 형성하는 요인을 이해하고 dendrite morphologies의 변화를 식별하는 능력은 신경계의 기능과 장애에 대한 이해에 필수적입니다.
Neurite의 형태는 종종 숄 분석에 의해 및 neurites 및 지점 팁의 수를 계산하여 분석합니다. 이 분석은 일반적으로 dendrites에 적용하지만, 그것은 axons에도 적용할 수 있습니다. 손으로 이러한 분석을 수행하면 시간이 소요 모두이며 필연적으로 실험자의 선입견과 불일치로 인해 다양성을 소개합니다. 모닥불 프로그램은 dendrite 사용 가능한 오픈 소스 형태학의 분석 도구에 따라 빌드 축삭의 형태의 분석 반 자동 방식입니다. 저희 프로그램은 neuritic 아버의 subregions에 숄 분석을 수행하여 동작을 분기 dendrite와 축삭의 로컬 변경 사항의 검색이 가능합니다. 예를 들어, 숄 분석은 전체적으로 신경 세포뿐만 아니라 프로세스의 각 부분 집합 (초등, 중등, 터미널, 뿌리 등) Dendrite 및 축삭의 patterning이 세포내 및 세포외 요인에 의해 영향을 모두 수행됩니다 많은 로컬 연기. 따라서, 결과 아버 형태는 이러한 지역의 변화 12 관찰하기 위해서는 작은 규모의 형태학의 분석을 수행하는 것이 필요하고, 특정 neurites에 연기 특정 프로세스의 결과입니다.
모닥불 프로그램은 두 오픈 소스 분석 도구 ImageJ 및 NeuronStudio에 NeuronJ 플러그인의 사용을 필요로합니다. 뉴런은 ImageJ에서 추적하고 있으며, NeuronStudio는 neurites 간의 연결을 정의하는 데 사용됩니다. 볼파이어 추가 분석을 위해 적절한 형식으로 데이터를 변환하는 데 사용되는 MATLAB (MathWorks)로 작성된 사용자 정의 스크립트 숫자를 포함하고, 사용자 오류를 확인하고, 궁극적 숄 분석을 수행합니다. 마지막으로, 데이터는 통계 분석을 위해 Excel로 내보낼 수 있습니다. 모닥불 프로그램의 플로우 차트는 그림 1에 표시됩니다.
Protocol
1. 당신이 시작하기 전에 :
1) E18 쥐 해부 :
E18 hippocampal 뉴런의 표준 절개 방법은 이전에 13 설명했습니다. neurites의 형태학의 특성을 분석 모닥불 프로그램을 사용하기 위해서는 개별 뉴런의 8 비트. TIF 이미지를 취득해야합니다. 이것은 당신이 다음하는 실험 프로토콜에 따라 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 하나의 뉴런은 현미경 필드에 표시되도록 뉴런은 낮은 충분한 밀도로 도금 수 있습니다. 또한, 고밀도 문화에 재배 이미지 각각의 뉴런에, 뉴런은 플라스미드 인코딩 형광 단백질로 transfection 다양한 방법을 사용하여 transfected 수 있습니다.
2) 소프트웨어 요구 사항 및 설치 :
- NIH와 NeuronStudio에서 ImageJ 소프트웨어 NeuronJ 플러그인은 모두 볼파이어 프로그램을 실행하기 위해 설치되어 있어야합니다. 소프트웨어 팩은는 다음 웹사이트에서 찾을 수 있습니다 :
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - 모닥불 프로그램은 http://lifesci.rutgers.edu/ ~ firestein에서 찾을 수 있습니다. 볼파이어 사용자 설명서는이 웹사이트에서 사용할 수 있습니다. 또한, 볼파이어의 초기 설명이 Langhammer 외, Cytometry 2010 년 찾을 수 있습니다. 우리의 모든 데이터는 Windows 운영 체제를 사용하여 분석하고 있습니다.
3) 이미지 해상도 조정 :
당신은 분석하고자하는 이미지의 이미지 해상도에 따라 볼파이어 프로그램을 조정해야합니다. 모닥불 프로그램의 bonfire_parameters 부분에서 이미지의 이미지 해상도의 값 (μm의 / 픽셀)로 변수 pix_conv에 대한 현재 가치를 바꿉니다.
2. 파일 구조 :
데이터를 분석하는 볼파이어하기 위해서, 파일은 특정 구조 (그림 2)로 구성해야합니다. 당신이해야합니다 :
- 마스터 폴더
- 하위 폴더 (귀하의 여러 조건을 각각 포함)
- 셀 이미지 파일 (filename.tif 파일)은 서로 다른 조건 폴더에 포함된
- 모닥불 Matlab mfiles을 포함 볼파이어 폴더 (역시 마스터 폴더에 포함된)
3. NeuronJ의 추적 뉴런 :
- 추적에 대한 이미지를 준비
- NeuronJ 도구 모음에서 '열기'버튼을 선택하고 추적하고자하는 이미지를 선택하여 이미지를 엽니다.
- '최대화'버튼을 선택하여 이미지 크기를 조정할 수 있습니다.
- 당신은 '조정 밝기 / 명암'을 선택 후 NeuronJ 도구 모음에서 '이미지'를 선택하여 neurites의 모든 시각화 수 있도록 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.
- NeuronJ의 세포 시체를 추적하고 '타입 06'것으로 흔적을 식별
- NeuronJ 도구 모음에있는 '추가 추적'버튼을 선택합니다.
- 세포 기관의 주위에 추적.
- NeuronJ 도구 모음에서 '레이블 Tracings'버튼을 선택합니다.
- 드롭 다운 메뉴의 'ID 추적'을에서 'N1'을 선택합니다.
- 선택 '유형 06'NeuronJ의 : 속성 창에서하고 '확인'을 선택합니다.
- NeuronJ에 neurites 추적
- NeuronJ 도구 모음에있는 '추가 추적'버튼을 선택합니다.
- 각 neurite 지점을 따라 추적을 추가합니다. 당신은 실험에 따라서만 dendrites 또는 축삭을 선택할 수 있습니다.
- 우리는 각각의 딸 지점 지점이 새로운 추적으로 그 시점에서 시작과 함께, 당신이 그릴 세그먼트는 각 지점의 지점에서 중지하는 것이 좋습니다.
- NeuronJ 도구 모음에서 '저장 Tracings'버튼을 선택합니다.
- 방금 원본 이미지 파일과 같은 폴더에 만들어 추적을 저장합니다.
- NeuronJ에서 추적 파일 및 추적 식별자 파일 내보내기
파일의 두 가지 유형이 NeuronJ에서 내보낸 및. TIF 및. ndf 파일과 함께 해당 조건 폴더에 저장해야합니다.- NeuronJ 도구 모음에서 '내보내기 추적'버튼을 선택합니다.
- NeuronJ 각 추적 '에 대한 옵션을'에 대한 별도의 파일 : "탭 - deliminated 텍스트 파일을 선택 내보내기 '대화 상자를 선택하십시오' 'OK.
- NeuronJ는 파일과 저장 위치의 이름을 선택하실 수 있습니다.
- NeuronJ 도구 모음에서 '측정 Tracings'버튼을 선택합니다.
- 'NeuronJ : 측정'에서 '디스플레이 추적 측정'옵션을 선택 창을하고 '실행'을 선택합니다.
- 창 : 'Tracings NeuronJ'에서 '파일'을 선택한.
- 선택 '다른 이름으로 저장'과 filen로 파일을 저장합니다ame_info. '파일 이름'은 정확하게 _info 다음에 원본 이미지 파일 (대소문자 포함)의 이름과 일치해야하고 3 문자 파일 확장명을 포함되어서는 안됩니다. 예를 들어, 원래 이미지 이름 Cell20.tif 들어,이 파일은 'Cell20_info'이라는 것입니다. 컴퓨터가 자동으로. xls 파일 확장명을 추가하지 않는다는 것을 확인하십시오. 그것이 없으면, 파일 확장자는 수동으로 삭제해야합니다.
4. . NeuronJ 데이터에서 예선 SWC 파일을 작성하기 위해 모닥불을 사용
- 'bonfire_load'을 사용하여 폴더를 재구성
- 더블이 아이콘을 클릭하여 Matlab을 엽니다.
- 명령 창 오른쪽 상단에있는 '버튼을 클릭합니다.
- 창의 '폴더에 대한 찾아보기'에서 마스터 폴더에있는 '볼파이어'폴더를 선택합니다.
- Matlab 명령 창에 입력하고 Enter를 누르십시오 'bonfire_load'을 입력합니다.
- 이 창에서 '폴더에 대한 찾아보기'에서 분석하고 '확인'을 선택하고자하는 조건 폴더를 선택합니다.
- 이것은 세포 각 세포에 대한 모든 데이터를 포함하는 하위 폴더를 생성하여 폴더 구조를 재구성합니다.
- 'bonfire_ndf2swc'을 사용 filename_prelim.swc 파일 만들기
- 명령 창에 입력하고 Enter를 누르십시오 'bonfire_ndf2swc'을 입력합니다.
- 방금 윈도우 '폴더에 대한 찾아보기'에서 'bonfire_load'로 개편 동일한 조건 폴더를 선택하고 '확인'을 선택합니다.
- 이것은 선택한 조건에 대한 각 셀에 폴더에. SWC 파일을 생성합니다. 각 셀에 폴더는 이제 5 파일을 포함합니다;. 원본 TIF 이미지, ndf 파일 _info 추적 식별자 파일, txt 파일 및 SWC 파일을....
5. 마무리 NeuronStudio를 사용 SWC 파일. :
- NeuronStudio의 신경 세포 이미지를 열고 보정
- NeuronStudio 프로그램을 엽니다.
- 파일 선택 → NeuronStudio 도구 모음에서 엽니다.
- 당신이 그것을 편집하고 열고자하는 신경 세포의. TIF 이미지를 찾아보세요.
- 선택 → 설정을 실행하고 Voxel 크기 '창에서'3 각에서 (X, Y, Z) 상자에 ''1를 입력합니다.
- 파일 선택 → 가져오기 SWC합니다. 적절한. SWC 파일을 선택합니다. 이미지 파일은 이제 추적 이미지와 중첩됩니다. 셀 소마는 빨간색 동그라미와 중첩되어야합니다.
- 링크 neurites에 NeuronStudio를 사용하여
- 제대로 지사 지점과 끝 지점을 식별하는 NeuronStudio의 도구를 사용하여 (우리는 당신이 당신의 데이터를 분석하기 전에 NeuronStudio의 기능과 단축키로 알게되는 것이 좋습니다).
- 특히, 노드 수 있도록 참여하는 'neurite 도구'를 사용 :
- 각 분기점 (노란색 노드)는 두 지점을 만들 수 있습니다
- 모든 흔적은 소마 (한 빨간색 노드)와 함께 지속적인 아르
- NeuronStudio에서 내보내기 데이터
- 파일 → 저장 Neurites (기본 이름으로 저장)를 선택합니다.
- 'bonfire_trace_check'을 사용하여 에러를 확인한다. SWC 파일
- Mathlab 명령 창에 입력하고 Enter를 누르십시오 'bonfire_trace_check'을 입력합니다.
- 방금 윈도우 '폴더에 대한 찾아보기'에서 처리 데이터를 포함하는 조건 폴더를 선택하고 '확인'을 선택합니다.
- 폴더에있는 이미지 중 하나에서 오류가있는 경우에는 프로그램이 오류가 위치 표시 이미지를 출력합니다.
- NeuronStudio에서 오류를 고정
- 당신이 수출 단계에서 저장한 이미지 파일을 엽니다.
- 찾아 문제 (들) 이후의 수정 프로그램입니다.
- 파일을 클릭 → Neurites을 저장합니다.
- 고정해야 다른 이미지를 반복합니다.
- 'bonfire_trace_check'(5.4)을 다시 실행합니다.
6. . SWC 파일에서 형태학의 데이터를 추출하기 위해 '모닥불'을 사용
- 명령 창에 입력하고 Enter를 누르십시오 '모닥불'을 입력합니다.
- 이 창에서 '폴더에 대한 찾아보기'에서 분석하고 '확인'을 선택하려는 데이터가 들어있는 상태 폴더를 선택합니다.
- 모닥불 분석은 분석에 사용된 숄 반지와 함께의 연결 형태를 그래프하는 분석되는 뉴런, 각각의 창문을 생성합니다. 또한, '모닥불'명령은 분석에서 가져온되었습니다 형태학의 모든 정보를 포함. 매트 파일을 생성합니다.
7. 데이터를 보려면 'bonfire_results'을 사용
- Matlab 명령 창에 입력 'bonfire_results.
- 이 창에서 '폴더에 대한보기'에서 확인하고 '확인'을 선택하고자하는 조건에 대한 조건 폴더를 선택합니다.
- 윈도우 '폴더에 대한 찾아보기'를하면 일시적으로 닫고 다시 열고, 당신이 보려는 추가 조건을 선택할 수 있습니다.
- 당신이 상태 폴더를 선택 완료되면, 선택 프로세스를 종료하려면 '취소'를 선택합니다.
- 'Bonfire_results'는 일을 포함하여 요약 차트를 반환합니다조건 폴더에서 전자 데이터를 당신이 선택되었습니다.
8. Excel로 데이터를 내보내기하려면 'bonfire_export'을 사용
- 명령 창에 입력 'bonfire_export.
- 상태 폴더가 윈도우 '폴더에 대한 찾아보기'에서 수출 및 '확인'을 선택하고자하는 데이터를 포함하는 선택합니다. Bonfire_export는 형태학의 데이터를 Excel 파일을 생성하고 선택된 조건 폴더에 배치됩니다.
9. 대표 결과 :
두 가지 조건을 포함하는 데이터 집합에있는 모닥불 프로그램에 의해 생성된 데이터의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 이 예제에서는 조건 1 뉴런은 세포 본체에 말초 더 neurites가 포함되어 있습니다. 이러한 현상은 총 돌기 아버 (그림 3A)의 숄 곡선 및 단말 지점 (그림 3C)의 수를 그래프에 나와있는 예제 이미지 (그림 3B)에서뿐만 아니라 볼 수 있습니다. 또한 모닥불 프로그램이 또한 이미지의 subregions에 숄 분석을 수행하기 때문에, 우리는 더 구체적으로 증가 neurites의 신원을 확인할 수 있습니다. 제 3의 순서 이상 neurites (그림 3 층)과 중간 및 단말 neurites 모두의 총 개수의 교차로의 총 수를 모두 (그림 3G) 휴대폰 본체에 말초 증가하고 있습니다. 이러한 경향은 또한 3D 및 3E 통계에서 볼 수 있습니다.
그림 1 :. 모닥불 프로그램의 플로우 차트 뉴런은 ImageJ를 사용하여 추적됩니다. 데이터는 수출 및 예비. SWC 파일로 볼파이어 프로그램에 의해 변환됩니다. NeuronStudio는 neurites의 연결을 정의하는 데 사용됩니다. 다음 모닥불 오류를 검사하고 숄 곡선, 초등, 중등, 고등 주문 neurites의 번호 및 지점 지점과 neurite 도움말의 개수를 계산합니다. 마지막으로, 데이터는 통계 분석을 위해 Excel로 내보낼 수 있습니다.
그림 2 : 파일 구조 볼파이어 분석에 필요한 파일 구조가 이런 프로그램이 제대로 실행되지 않습니다 일치해야합니다.. 폴더와 파일 및 폴더와 파일의 수량의 이름은 변경할 수 있습니다.
그림 3 : 볼파이어 프로그램에서 예제 출력 데이터) 총 숄 곡선.. B) 예 모두 조건의 이미지를 반전. 지사 지점과 터미널 지점 / 셀 C) 평균 수. 초등, 중등, 그리고 차 이상 neurites을위한 프로세스 / 조직의 D) 평균 수. 프로세스 / 루트에 대한 세포, 중급, 터미널 neurites의 E) 평균 수. F) 세그먼트 ID를 특정 숄 분석 곡선. 세그먼트는 초등, 중등, 또는 차 이상으로 그룹화됩니다. G) 세그먼트 ID를 특정 숄 분석 곡선. 세그먼트는 루트 세그먼트, 중간 세그먼트, 또는 터미널 세그먼트로 그룹화됩니다.
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Discussion
모닥불 프로그램은 dendrite와 축삭의 형태의 분석을위한 세미 자동 프로그램입니다. 그것은 크게 수동으로 분석을 수행하는 동안 숄 분석의 효율성 및 정확성을 증가시킵니다. 또한, 볼파이어 프로그램이 가능한 데이터를 감사하고 분석의 정확성을 확인하고, 프로세스의 모든 단계에서 데이터를 저장합니다. 따라서, 데이터 분석의 작업은 손상없이 정확하게 많은 개인에게 배포할 수 있습니다. 마지막으로, 이미지의 subregions에 대한 분석을 수행하여, 프로그램 숄 분석에만 전체 dendrite 또는 축삭 아버에서 실행되는 놓친 아르 분기의 로컬 변경 사항을 식별할 수 있습니다. 저희 프로그램은 neurites의 특정 하위 집합은 셀 본문에 대한 참고 자료를 배열하는 방법 식별할 수 있습니다. 그 결과, 이미지 분기 패턴은 볼파이어 프로그램에 의해 생성되는 데이터에 의해 잘 표현하고 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다. 자금 조달 기관 볼파이어의 개발에 과학적 역할을 없었다.
Acknowledgments
이 작품은 부시 의생명 그랜트, NSF 그랜트 이븐 - 0548543, NSF 그랜트 이븐 - 0919747, 천 재단 그랜트 1 - FY04 - 107 3 월, 천 재단 그랜트 1 - FY08 - 464 3 월 (BLF로)에 의해 부분적으로 지원되었다. MKK과 CGL은 NIH 생명 교육 그랜트 T32 GM008339 - 20 지원했고, CGL 또한 척수 연구 Predoctoral 원정대 08-2941 - SCR - E - 0에 대한 NJ위원회에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
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