Summary
Biz nöron morfolojisi analiz etmek için bir bilgisayar programı geliştirdik. Mevcut iki açık kaynak kodlu analiz araçları ile birlikte, program Sholl analiz yapar ve neurites, şube noktaları ve neurite ipuçları sayısını belirler. Analizler neurite morfolojisi yerel değişiklikler görülebilir şekilde yapılmaktadır.
Abstract
Nöronal morfolojisi, nöron fonksiyonu ve 1-3 nasıl iletişim belirlenmesinde önemli bir rol oynar . Özellikle, diğer hücrelere girişleri almak için nöronların yeteneğini etkiler 2 ve 4,5 aksiyon potansiyelleri yayılma katkıda bulunur. Neurites morfolojisi de bilgilerin nasıl işlendiğini etkiler. Dendrit morfolojileri çeşitliliği, yerel ve uzun menzilli sinyalizasyon kolaylaştırmak ve, bireysel nöron nöron veya gruplar 6,7 nöronal ağ içinde özel görevleri yerine getirebilmek için izin . Alzheimer hastalığı 8, 9,10 şizofreni, mental retardasyon 11 de dahil olmak üzere bir dizi hastalık durumlarında, dendritler ve desen dallanma değişiklikleri parçalanması dahil, dendrit morfolojisi değişiklikler gözlenmiştir. Hem dendrit morfolojileri şekillendiren faktörleri anlamak ve dendrit morfolojileri değişiklikleri belirlemek için yeteneği, sinir sisteminin fonksiyonu ve disfonksiyonu anlayışı esastır.
Neurite morfolojisi genellikle Sholl analiz ve şube ipuçları neurites ve sayısı sayısını sayma tarafından analiz edilir. Bu analiz genellikle dendritler uygulanır, ancak bu aksonlar için de uygulanabilir. Elle bu analizin yapılması, hem zaman alıcı hem de ve kaçınılmaz olarak deneyci önyargı ve tutarsızlık nedeniyle değişkenlik tanıtır. Bonfire programı, açık kaynak morfolojik analiz araçları üzerine inşa dendrit ve akson morfolojisi analizi için bir yarı-otomatik bir yaklaşımdır. Bizim program nöritik mili alt bölgelerini Sholl analiz yaparak davranışları dallanma dendrit ve akson yerel değişiklikler tespit sağlar. Örneğin, Sholl analiz, bir bütün olarak nöron Dendrit ve akson desenlendirme bir dizi hücre içi ve hücre dışı faktörler tarafından etkilenir (ilköğretim, ortaöğretim, terminal, root, vb) her alt süreçlerin yanı sıra hem yapılan birçok yerel hareket. Böylece, ortaya çıkan mili morfolojisi belirli neurites hareket eden bu yerel varyasyonlar 12 gözlemlemek için daha küçük bir ölçekte morfolojik analizini gerçekleştirmek için gerekli özel süreçlerin bir sonucudur.
Bonfire programı, açık kaynak kodlu iki analiz araçları, ImageJ ve NeuronStudio NeuronJ eklenti kullanımını gerektirir. Nöronlar ImageJ takip ve NeuronStudio neurites arasında bağlantı tanımlamak için kullanılır. Bonfire verileri detaylı analiz için uygun bir biçime dönüştürmek için kullanılan özel komut dosyaları MATLAB (MathWorks) yazılmış bir dizi, kullanıcı hataları için kontrol edin ve sonuçta Sholl analizi gerçekleştirmek. Son olarak, verilerin istatistiksel analizi için Excel içine ihraç edilmektedir. Bonfire program akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Protocol
1. Başlamadan önce:
1) E18 sıçan diseksiyonu:
E18 hipokampal nöronlar Standart diseksiyon yöntemleri daha önce 13 tarif edilmiştir . Neurites morfolojik özelliklerini analiz Bonfire programı kullanmak için, bireysel nöronların 8 bit. Tif görüntüleri elde edilmelidir. Bu yollar şunlardır deneysel protokol bağlı olarak bir dizi yapılabilir. Tek nöronlar mikroskop alanında görünecek şekilde Nöronlar yeterince düşük bir yoğunlukta kaplama olabilir. Alternatif olarak, yoğun bir kültür yetiştirilen görüntü bireysel nöronlar, nöronlar plazmid floresan protein kodlama ile transfeksiyon yöntemleri kullanarak çeşitli transfekte olabilir.
2) Yazılım Gereksinimleri ve Kurulum:
- NIH ve NeuronStudio ImageJ yazılım NeuronJ eklentisi Bonfire programı çalıştırmak için yüklü olmalıdır. Yazılım paketleri aşağıdaki web adresinde bulunabilir:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - Bonfire programı http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein bulunabilir. Bu web sitesinde Bonfire kullanım kılavuzu da mevcuttur. Ayrıca, Bonfire ilk açıklama Langhammer ve ark, 2010 Sitometri bulunabilir. Tüm verileri bir Windows işletim sistemi kullanılarak analiz edilmiştir.
3) Görüntü Çözünürlüğü Ayarı:
Bonfire programı, analiz etmek istediğiniz görüntüleri görüntü çözünürlüğüne göre ayarlamanız gerekir. Bonfire programı bonfire_parameters kısmında, görüntülerin değeri (mm / piksel) görüntü çözünürlüğü ile değişken pix_conv için geçerli değeri değiştirin.
2. Dosya Yapısı:
Bonfire verileri analiz etmek amacıyla, dosyalar bu özel yapısı (Şekil 2) organize edilmesi gerekir. Olacak:
- Bir ana klasör
- Alt klasörler (her biri farklı koşullar içeren)
- Farklı koşulu klasörlerinde yer alan Hücre görüntü dosyaları (filename.tif dosyaları)
- Bonfire Matlab mfiles içeren bir Bonfire klasörüne (ana klasör içinde bulunan)
3. NeuronJ İzleme Nöronlar:
- Görüntü izleme için hazırlayın
- NeuronJ araç çubuğunda 'Open' düğmesini seçerek ve görüntü izlemek istiyorum seçerek görüntüyü açın.
- 'En üst düzeye çıkarmak' düğmesini seçerek görüntüyü yeniden boyutlandırın.
- 'Ayarlayın parlaklık / kontrast' seçtikten sonra, NeuronJ araç çubuğunda 'Resim' seçilerek tüm neurites görselleştirmek, böylece görüntünün parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.
- NeuronJ hücre gövdesi İz ve 'Type 06' izleme olarak tanımlamak
- NeuronJ araç çubuğunda 'Ekle İzleri' düğmesini seçin.
- Hücre gövdesi çevresinde iz.
- NeuronJ araç çubuğunda 'Etiket iz' düğmesini seçin.
- Açılan menüden "ID İzleme '' N1 'seçin.
- Seç 'Tip 06' NeuronJ: Öznitelikler pencere ve 'Tamam'ı seçin.
- NeuronJ içinde neurites İz
- NeuronJ araç çubuğunda 'Ekle İzleri' düğmesini seçin.
- Her neurite şube boyunca bir iz ekleyin. Denemenizi bağlı olarak, sadece dendrit ve akson seçebilirsiniz.
- Biz bu noktada yeni bir eser olarak başlayan her kızı şube noktası, çizdiğiniz bölümleri her şube noktada durdurmak öneririz.
- NeuronJ araç çubuğunda 'Kaydet iz' düğmesini seçin.
- Sadece orijinal görüntü dosyası ile aynı klasörde oluşturduğunuz izleme kaydedin.
- NeuronJ izleme dosyaları ve İhracat iz tanımlayıcı dosyası
İki tip dosyaları NeuronJ ihraç edilen ve uygun durumda klasörler halinde kaydedilir. Tif ve. Ndf dosyaları ile birlikte olmalıdır.- NeuronJ araç çubuğunda 'İhracat Trace' düğmesini seçin.
- NeuronJ her izleme 'seçeneği' için ayrı bir dosya: "Sekme deliminated metin dosyaları seçin İhracat 'diyalog kutusunu seçin ve' Tamam.
- NeuronJ dosyaları ve kaydetme konumu isimleri seçmesine izin ver.
- NeuronJ araç çubuğunda 'Ölçü iz' düğmesini seçin.
- 'NeuronJ: Ölçümler' 'Görüntü izleme ölçümleri' seçeneğini seçin ve pencere 'Çalıştır'ı seçin.
- Penceresi: 'iz NeuronJ' seç 'Dosya'.
- 'Farklı Kaydet' ve filen olarak dosyayı kaydediname_info. 'Dosyaadı' _info takip orijinal görüntü dosyası (harfler dahil) adını tam olarak eşleşmelidir ve 3 harfli dosya uzantısı içermemelidir. Örneğin, orijinal görüntü adını Cell20.tif için, bu dosyayı 'Cell20_info' adlı olacaktır. Bilgisayarınız otomatik olarak bir. Xls dosya uzantısı eklemek olmadığını kontrol edin. Eğer dosya uzantısını elle silinmesi gerekir.
4. Build NeuronJ Veri Ön swc Dosyalar Bonfire kullanın:
- 'Bonfire_load' kullanarak klasörleri yeniden düzenleme
- Matlab simgeye çift tıklayarak açın.
- Komut penceresinin sağ üst köşesindeki 'düğmesine tıklayın.
- 'Klasör için Gözat' pencere ana klasörde 'Bonfire' klasörü seçin.
- Matlab komut penceresi ve basın içine Türü 'bonfire_load' girin.
- Penceresi 'Klasör için Gözat' analiz ve 'Tamam'ı seçin istediğiniz durum klasörü seçin.
- Bu, hücre her bir hücre için tüm verileri içeren bir alt klasör oluşturarak klasör yapısını yeniden organize edecektir.
- 'Bonfire_ndf2swc' kullanarak filename_prelim.swc dosyaları oluşturun.
- Türü 'bonfire_ndf2swc komut penceresi ve basın içine girin.
- Sadece 'Klasör için Gözat' pencere 'bonfire_load' ile yeniden organize aynı durum klasörü seçin ve 'OK' i seçin.
- Bu durum için her hücre klasörü. Swc dosyası yaratacaktır. Her bir hücre klasörü şimdi 5 resimler içeren orijinal tif görüntü, ndf dosya _info iz tanımlayıcı dosyası, txt dosyası ve swc dosya....
5. Finalize NeuronStudio kullanın swc Dosyaları.
- NeuronStudio nöron görüntüleri açın ve kalibre
- NeuronStudio programını açın.
- Dosya seçin → NeuronStudio araç çubuğunu açın.
- Nöronun düzenlemek ve açmak istiyorum. Tif görüntü bulun.
- → Ayarlar çalıştırın ve Voksel Boyutu 'penceresi' her 3 (X, Y, Z) kutuları içerisine '1 'girin.
- Dosya seçin → İthalat SWC. Uygun. Swc dosya seçin. Görüntü dosyası şimdi bir iz görüntü ile kaplanmış olacaktır. Hücre soma kırmızı bir daire ile kaplanmış olmalıdır.
- Bağlantı neurites NeuronStudio kullanın.
- Doğru dallanma noktaları ve bitiş noktalarını tespit etmek NeuronStudio araçlarını kullanın (veri analiz etmeden önce NeuronStudio özellikleri ve kısayolları ile tanışırlar öneririz).
- Özellikle, böylece düğümleri katılmak için, 'neurite aracı' kullanın:
- Her şube noktası (sarı düğümleri), yalnızca iki şubesinde oluşturabilirsiniz
- Tüm izleri soma (sadece tek bir kırmızı düğümü) ile sürekli
- NeuronStudio gelen ihracat verileri
- Dosya → Kaydet Neurites (varsayılan ad olarak kaydetmek) seçin.
- 'Bonfire_trace_check' kullanarak swc dosyaları hatalar için kontrol edin.
- Türü 'bonfire_trace_check' mathlab komut penceresi ve basın içine girin.
- Durumu sadece 'Klasör için Gözat' pencere işlenmiş verileri içeren klasörü seçin ve 'OK' i seçin.
- Herhangi bir klasördeki görüntülerin herhangi bir hata varsa program hata nerede görüntüleyerek görüntüleri çıktı.
- NeuronStudio içinde hataların düzeltilmesi
- Ihracatçı adımda kaydedilen görüntü dosyasını açın.
- Bulun ve sorun (lar) düzeltmek.
- Dosya → Neurites Kaydet.
- Düzeltilmesi gereken diğer görüntüler için tekrarlayın.
- 'Bonfire_trace_check' (5.4) yeniden çalıştırın.
6. Morfolojik Veri ayıkla. Swc Files 'şenlik ateşi' kullanın:
- Türü 'şenlik ateşi' komut penceresi ve basın içine girin.
- Penceresi 'Klasör için Gözat' analiz ve 'Tamam'ı seçin istediğiniz verileri içeren durum klasörü seçin.
- Bonfire analizi analizinde kullanılan Sholl halkaları ile birlikte nöronal morfoloji grafikler hangi nöronların, analiz edilen her biri için bir pencere oluşturacaktır. Ayrıca, 'şenlik ateşi' komutu tüm morfolojik bilgileri analize alınmıştır içeren mat dosyası üretecektir.
7. Veri Görünümü 'bonfire_results' kullanın:
- Matlab komut penceresi içine Türü 'bonfire_results'.
- 'Klasör için Gözat' pencere görünümü ve 'Tamam' seçeneğini istiyorum durum için durumu klasörü seçin.
- Pencere 'Klasöre Gözat' geçici olarak kapatın ve yeniden açın, görüntülemek istiyoruz ek koşullar seçmenize olanak tanır.
- Durum klasörleri seçtikten bittiğinde, seçim süreci çıkmak için 'İptal' seçeneğini seçin.
- 'Bonfire_results' inci dahil olmak üzere özet çizelgeleri dönecektirdurumu klasörlerdeki e veri seçtiğiniz.
8. Excel'e Veri Aktarma 'bonfire_export' kullanın:
- Komut penceresi içine Türü 'bonfire_export'.
- Durumu 'Klasör için Gözat' pencere ihracat ve 'Tamam' seçeneğini istediğiniz verileri içeren klasör seçin. Bonfire_export morfolojik verilerin Excel dosyaları oluşturmak ve seçildi koşul klasörüne koyun.
9 - Temsilcisi Sonuçlar:
Iki koşul içeren bir veri seti üzerinde Bonfire programı tarafından üretilen veriler bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu örnekte, Durum 1 nöron hücre gövdesi distalinde daha neurites içerir. Bu olgu, toplam dendritik çardak (Şekil 3A) Sholl eğrisi ve terminal noktaları (Şekil 3C) sayısı grafikte örnek görüntüleri (Şekil 3B) gibi görülebilir . Ayrıca, Bonfire program aynı zamanda görüntülerin alt bölgelerini Sholl analiz yapar, çünkü biz daha özel artmıştır neurites kimliğini tespit edebilmek. 3. düzeni veya daha fazla neurites (Şekil 3F) ve hem de aracılık ve terminal neurites toplam sayısı kavşakların toplam sayısı Her ikisi de (Şekil 3G) hücre gövdesi distal artar. Bu eğilimler aynı zamanda 3D ve 3E Rakamlar görülebilir .
Şekil 1: Bonfire program akış şeması Nöronlar ImageJ kullanılarak izlenebilir. Veriler daha sonra ihraç edilen ve ön hazırlık. Swc dosyaları içine Bonfire program tarafından dönüştürülür. NeuronStudio neurites bağlantı tanımlamak için kullanılır. Bonfire hataları denetler ve sonra Sholl eğrileri, ilkokul, ortaokul, ve yüksek sipariş neurites sayısı ve şube noktaları ve neurite ipuçları sayısını hesaplar. Son olarak, verilerin istatistiksel analizi için Excel ihraç edilmektedir.
Şekil 2: Dosya yapısı Bonfire analiz için gerekli dosya yapısı ya da program düzgün çalışmaz eşleşmelidir. Klasörleri ve dosyaları ve klasörleri ve dosyaları miktar isimleri değiştirilebilir.
Şekil 3: Örnek Bonfire programı çıkış verileri A) Toplam Sholl eğrileri. B) Örnek ters iki durumun görüntüleri. C) şube noktaları ve terminal noktaları / hücre ortalama sayısı. D), birincil, ikincil ve üçüncül veya daha fazla neurites süreçleri / hücre ortalama sayısı. E) süreçleri / kök hücre, orta, ve terminal neurites ortalama sayısı. F) Bölüm kimliği belirli Sholl analiz eğrileri. Kesimleri birincil, ikincil veya üçüncül veya daha fazla olarak gruplandırılmış. G) Bölüm kimliği belirli Sholl analiz eğrileri. Kesimleri, kök segmentleri, ara segmentler, veya terminal segmentleri gibi gruplandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bonfire program dendrit ve akson morfolojisi analizi için bir yarı-otomatik bir program. Büyük ölçüde elle analizlerinin yapılması üzerinde Sholl analiz verimliliği ve doğruluk artar. Buna ek olarak, mümkün veri denetim ve analiz doğruluğunu kontrol etmek için Bonfire programı yapım sürecinin her aşamasında verileri kaydeder. Bu nedenle, veri analizi görev doğruluğu ödün vermeden sayısız bireyler için dağıtılacak. Son olarak, görüntülerin alt bölgelerini analiz yaparak, programı Sholl analizi, sadece tüm dendrit ve akson çardak çalıştırıldığında cevapsız dallanma olarak yerel değişiklikleri tespit etmek mümkün. Programımız neurites belirli altkümelerini hücre gövdesi referans nasıl düzenlenir tanımlamak mümkün. Sonuç olarak, görüntüler dallanma desen Bonfire program tarafından oluşturulan veri tarafından iyi temsil edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim. Finansman kurumları Bonfire gelişimi hiçbir bilimsel bir rol oynamıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma bir Busch Biyomedikal Grant, NSF hibe IBN-0548543, NSF hibe IBN-0919747, Dimes Vakfı Hibe 1-MY04-107 Mart, Dimes Vakfı Hibe 1-FY08-464 Mart (BLF) tarafından kısmen desteklenmiştir. MKK ve CGL, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Biyoteknoloji Eğitim Grant T32 GM008339-20 tarafından desteklenen ve CGL Omurilik Araştırma predoctoral Kardeşliği 08-2941-SCR-E-0 da bir NJ Komisyonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
