Summary
我们已经开发出一种计算机程序来分析神经元的形态。在两个现有的开源分析工具的结合，我们的计划执行肖尔，分析和确定的突起，分支点和突起的提示。进行分析，使地方在突起的形态变化可以观察。
Abstract
神经元的形态起着重要作用，决定神经元功能和沟通 1-3 。具体来说，它会影响神经元接收来自其他细胞的投入能力 2的动作电位 4,5的传播作出贡献。也影响了信息处理的突起的形态。树突形态的多样性，促进本地和远距离信号，并允许单个神经元或神经元组进行6,7神经网络内专门的职能。在枝晶形态的改变，包括树突分支模式的变化的碎片，已经观察到在一些疾病状态，其中包括阿尔茨海默氏病 ，精神分裂症9,10， 精神发育迟滞11。既了解形状枝晶形貌的因素，并确定在枝晶形貌变化的能力是在神经系统的功能和功能障碍的认识至关重要。
突起的形态往往是分析肖尔分析和计算突起和枝梢。这种分析是普遍适用的树突，但它也可以应用到轴突。手工执行这个分析既耗时，不可避免地引入了变异由于实验者的偏见和不一致。篝火方案是一个半自动化的枝蔓和轴突形态时提供开放源码的形态分析工具为基础的分析方法。我们的计划，使当地在枝蔓和轴突分支行为的变化神经炎乔木的分区域执行肖尔分析检测。例如，肖尔分析是神经元树突和轴突的图案是由许多细胞内外因素的影响，在每个进程的一个子集（小学，中学，终端，根等），以及作为一个整体，许多署理本地。因此，由此产生的乔木形态，是一种作用于特定的突起，因此有必要执行规模较小的形态分析， 以观察这12个地方差异的具体进程的结果。
篝火程序需要使用两个开源分析工具，NeuronJ插件ImageJ和NeuronStudio。神经元追踪ImageJ，NeuronStudio是用来定义突起之间的连接。篝火包含在MATLAB（MathWorks公司）编写的自定义脚本是用来作进一步的分析数据转换成相应的格式，请检查用户的错误，并最终执行肖尔分析。最后，数据导出到Excel进行统计分析。一个篝火程序的流程图如图1所示。
Protocol
1。开始之前：
1）E18大鼠夹层：
E18海马神经元的标准清扫方法以前曾描述 13 。为了使用篝火方案的突起的形态特征进行分析，8位。TIF的单个神经元的图像，必须获得。这可以实现的方式取决于你下面的实验协议。神经元可镀在一个足够低的密度，使单个神经元出现在显微镜领域。另外，图像，是生长在一个密集的文化的单个神经元，神经元可转用一种荧光蛋白的质粒编码的各种转染方法。
2）软件要求及安装：
- 从美国国立卫生研究院和NeuronStudio ImageJ软件NeuronJ插件必须都安装才能运行的篝火方案。软件包可在以下网站找到：
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - 可以发现在http://lifesci.rutgers.edu/〜firestein篝火方案。篝火用户手册，也可在本网站。此外，篝火最初的描述，可以发现在翰墨2010年，流式细胞仪等。我们所有的数据进行了分析，使用的是Windows操作系统。
3）图像分辨率调节：
您将需要调整的基础上要分析的图像，图像分辨率的篝火方案。在篝火计划bonfire_parameters的一部分，取代当前值与您的影像（微米/像素）的图像分辨率值的变量pix_conv。
2。文件的结构：
为了篝火来分析数据，文件必须是有组织的在这个特定的结构（ 图2）。您将拥有：
- 一个主文件夹
- 子文件夹（包含您的每一个不同的条件）
- 在不同条件下的文件夹中包含细胞图像文件（filename.tif文件）
- 篝火文件夹中包含的篝火MATLAB mfiles（也包含在主文件夹）
3。 NeuronJ跟踪神经元：
- 准备跟踪图像
- 打开NeuronJ工具栏上选择“打开”按钮，选择你想跟踪的图像图像。
- 选择“最大化”按钮的大小的图像。
- 调整图像的亮度和对比度，让你可以想像NeuronJ工具栏上选择“图像”，然后选择“调整亮度/对比度”的突起。
- 在NeuronJ跟踪的细胞体，并确定为“06型”跟踪
- 选择“添加痕迹”的NeuronJ工具栏上的按钮。
- 跟踪周围的细胞体的周长。
- 选择“标签追查”上的NeuronJ工具栏上的按钮。
- 从“跟踪ID”下拉菜单中选择“N1”。
- 类型选择“06”在NeuronJ：属性窗口，选择“OK”。
- 跟踪NeuronJ的突起
- 选择“添加痕迹”的NeuronJ工具栏上的按钮。
- 添加每个突起的分支沿痕迹。您可以选择只树突或轴突，这取决于您的实验。
- 我们建议，你画的段停留在每个分支点，每个女儿的分支点，在这一点上开始一个新的跟踪。
- 选择NeuronJ工具栏上的“保存描”按钮。
- 保存跟踪你刚才创建在同一文件夹中的原始图像文件。
- 从NeuronJ导出的跟踪文件和跟踪标识符文件
两种类型的文件，必须从NeuronJ出口和到相应的条件文件夹一起保存。tif和NDF文件。- NeuronJ工具栏上选择“导出跟踪”按钮。
- 选择“deliminated标签文本文件：每个跟踪”选项“NeuronJ单独的文件：导出”对话方块，选择“OK”。
- 允许NeuronJ选择的文件的名称和保存位置。
- 选择NeuronJ工具栏上的“测量描”按钮。
- 选择“显示跟踪测量”选项“NeuronJ：测量”窗口，选择“运行”。
- “NeuronJ：描”窗口中选择“文件”。
- 选择“另存为”保存文件作为filename_info。 “文件名”必须完全匹配的原始图像文件（包括大小写），由_info的名称，不应该包含3个字母的文件扩展名。例如，对于原始图像名称Cell20.tif，这个文件将被命名为“Cell20_info”。检查您的计算机不会自动添加。xls文件扩展名。如果确实如此，必须手动删除的文件扩展名。
4。使用篝火构建NeuronJ数据的初步SWC文件。
- 使用“bonfire_load重组文件夹”
- 双点击图标打开MATLAB。
- 在命令窗口的右上角点击“”按钮。
- 选择“篝火”在您的主文件夹“浏览文件夹”窗口中的文件夹。
- 类型“bonfire_load到MATLAB命令窗口，然后按ENTER键。
- 选择的条件，要分析在“浏览文件夹”窗口，选择“OK”的文件夹。
- 这将重组，通过创建细胞子文件夹包含所有为每个单元格的数据文件夹结构。
- 创建使用'bonfire_ndf2swc“的filename_prelim.swc文件
- 键入“bonfire_ndf2swc”进入命令窗口，然后按ENTER键。
- 选择相同的条件下的文件夹，你只是在“浏览文件夹”窗口“bonfire_load”重组并选择“确定”。
- 这将创建一个在每个单元的文件夹。SWC文件选择条件。现在每个单元文件夹将包含5个文件;原来的TIF图像，NDF文件，_info的跟踪标识符文件，TXT文件和SWC文件。。。
5。使用NeuronStudio敲定SWC文件。
- 打开和校准NeuronStudio神经元图像
- 打开NeuronStudio的程序。
- 选择“文件→打开NeuronStudio工具栏上。
- 找到你要编辑并打开它的神经元。TIF图像。
- 选择“运行”→“设置，输入”3（X，Y，Z）在盒“体素大小”窗口“。
- 选择“文件→导入深港西部通道。选择适当的SWC文件。现在的图像文件将被覆盖与跟踪图像。细胞SOMA应覆盖一个红色圆圈。
- 使用NeuronStudio链接突起
- 在NeuronStudio使用的工具，正确识别分支点和结束点（我们建议您成为熟悉分析数据之前NeuronStudio的功能和快捷键）。
- 具体来说，使用的“突起工具”加入节点，以便：
- 每个分支点（黄节点）只能创建两个分支
- 所有痕迹连续与SOMA（只有一个红色节点）
- 从NeuronStudio数据导出
- 选择“文件→保存突起（保存为默认名称）”。
- 在错误检查。SWC文件使用“bonfire_trace_check”
- 键入“bonfire_trace_check到MATHLAB命令窗口，然后按ENTER键。
- 选择条件的文件夹，包含你刚才在“浏览文件夹”窗口中处理的数据，并选择“确定”。
- 如果有任何文件夹中的图像的任何错误，程序将输出图像显示错误的位置是位于。
- 修复错误在NeuronStudio
- 打开图像文件保存在出口一步。
- 找到并解决的问题（S）。
- 单击“文件→保存突起。
- 重复其他图像，需要修复。
- 重新运行“bonfire_trace_check”（5.4）。
6。使用“篝火”，从SWC文件中提取形态学数据。：
- 键入“篝火”进入命令窗口，然后按ENTER键。
- 选择条件文件夹包含您要分析的“浏览文件夹”窗口中的数据，并选择“确定”。
- 篝火分析会生成一个窗口为每个被分析的神经元，它的图形与在分析中使用的肖尔环的神经元的形态。此外，“篝火”命令将生成。mat文件包含所有已采取从分析的形态学信息。
7。使用“bonfire_results查看数据：
- 到MATLAB命令窗口中键入“bonfire_results”。
- 选择条件为条件，你想查看“浏览文件夹”窗口，选择“OK”文件夹。
- 的“浏览文件夹”窗口，将暂时关闭并重新打开，让你选择你想观看的附加条件。
- 当您完成选择条件的文件夹，选择“取消”退出遴选过程。
- “Bonfire_results”将返回摘要图表，包括日您选择的条件文件夹E数据。
8。使用“bonfire_export数据导出到Excel：
- 在命令窗口中键入“bonfire_export”。
- 选择条件的文件夹中包含的数据，你想出口在“浏览文件夹”窗口，选择“OK”。 Bonfire_export将创建的形态数据的Excel文件将放置在他们选择的条件文件夹。
9。代表性的成果：
如图3所示的数据包含两个条件的设置上的篝火方案所产生的数据的一个例子。在这个例子中，条件1神经细胞中含有较多的突起，远端的细胞体。例如图像（ 图3B），以及在总树突状乔木（ 图3A）肖尔曲线，并在图形终端点（ 图 3C），可以观察到这种现象。此外，由于篝火方案还执行肖尔的图像分区域分析，我们能够更具体的确定有增加的突起的身份。 三阶或更大的突起（ 图3F），中介和终端突起总数的交点总数（图 3G）增加远端的细胞体。这些趋势也可以观察到的数字3D和3E。
图1：篝火程序流程图神经元 。使用ImageJ跟踪。然后，将数据的出口，并转换成是初步的。SWC文件的篝火方案。 NeuronStudio是用于定义连接的突起。篝火检查错误，然后计算肖尔曲线，小学，中学，以及更高的秩序突起，分支点和突起的提示。最后，数据导出到Excel进行统计分析。
图2：文件结构所需的篝火分析文件的结构必须符合或程序将无法正常运行 。文件夹和文件，文件夹和文件的数量，名称可以改变。
图3：从篝火方案示例输出数据 a）总肖尔曲线 。二）范例倒了这两个条件的图像。三）分支点和终端点/细胞的平均数量。四）流程/细胞的平均人数为小学，中学，大专或更大的突起。五）流程/根，中间细胞和终端突起的平均人数。 F）的分部特定身份肖尔分析曲线。段分为小学，中学，大专或更大。 G）的分部特定身份肖尔分析曲线。段归根段，中间段，或终端市场。
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Discussion
篝火方案是一个半自动化的方案，枝蔓和轴突形态分析。这大大增加了超过手动执行分析肖尔分析的效率和准确性。此外，篝火程序保存在每一步的过程数据，从而有可能审核数据，并验证了分析的准确性。因此，数据分析的任务可以被分配给许多个人，而不影响精度。最后，由执行上的图像分区域进行分析，该方案是能够识别肖尔分析仅仅是对整个枝蔓或轴突乔木运行时错过当地的分支。我们的计划是能够确定如何排列在细胞体内的特定子集的突起。因此，在图像的分支模式为代表的篝火程序生成的数据。
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Disclosures
作者宣称没有利益争夺。供资机构在篝火的发展并没有科学的作用。
Acknowledgments
这项工作是支持部分由一个生物医学布希批准，美国国家科学基金会资助IBN - 0548543，美国国家科学基金会资助IBN - 0919747，优生优育基金会基金会赠款1 - 2004财年的107的3月，三月优生优育基金会基金会赠款1 - 2008财年的464（BLF）。由美国国立卫生研究院生物技术培训津贴T32 GM008339 - 20 MKK和CGL的支持，CGL的是由新泽西州委员会也支持脊髓研究Predoctoral奖学金08 - 2941 - SCR - E - 0。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
