Summary
हम neuronal आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए एक कंप्यूटर प्रोग्राम विकसित किया है. दो मौजूदा खुला स्रोत विश्लेषण उपकरणों के साथ संयोजन में, हमारे कार्यक्रम Sholl विश्लेषण करता है और neurites, शाखा अंक, और neurite सुझावों की संख्या निर्धारित करता है. विश्लेषण इतना प्रदर्शन कर रहे हैं कि neurite आकारिकी में स्थानीय परिवर्तन देखा जा सकता है है.
Protocol
1. इसके पहले कि आप शुरू करें:
1) E18 चूहे विच्छेदन:
E18 hippocampal न्यूरॉन्स के मानक विच्छेदन तरीकों पहले 13 वर्णित किया गया है . आदेश में होलिका कार्यक्रम का उपयोग करने के लिए neurites के morphological विशेषताओं का विश्लेषण करते हैं, 8 बिट व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के tif छवियों प्राप्त होना चाहिए. यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आप का अनुसरण कर रहे हैं पर निर्भर करता है तरीकों की एक संख्या में पूरा किया जा सकता है. न्यूरॉन्स एक काफी कम घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है इतना है कि एक न्यूरॉन्स खुर्दबीन क्षेत्र में दिखाई देते हैं. वैकल्पिक रूप से, छवि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स कि एक घने संस्कृति में बड़े हो रहे हैं, न्यूरॉन्स एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अभिकर्मक तरीकों की एक किस्म का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है.
2) सॉफ्टवेयर जरूरत और स्थापना:
- NIH और NeuronStudio से ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए NeuronJ प्लगइन दोनों क्रम में होलिका कार्यक्रम चलाने के लिए स्थापित होना चाहिए. सॉफ्टवेयर पैक निम्नलिखित वेबसाइटों पर पाया जा सकता है है:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - होलिका कार्यक्रम http://lifesci.rutgers.edu/ ~ firestein पर पाया जा सकता है है. होलिका उपयोगकर्ता पुस्तिका भी इस वेबसाइट पर उपलब्ध है. इसके अतिरिक्त, होलिका के प्रारंभिक वर्णन Langhammer एट अल, 2010 Cytometry में पाया जा सकता है है . हमारे सभी डेटा के एक विंडोज़ ऑपरेटिंग सिस्टम का उपयोग विश्लेषण किया गया है.
3) छवि संकल्प समायोजन:
आप होलिका छवियों है कि आप का विश्लेषण करना चाहते हैं छवि संकल्प पर आधारित कार्यक्रम को समायोजित करने की आवश्यकता होगी. होलिका कार्यक्रम के bonfire_parameters भाग में, आपकी छवियों की छवि संकल्प के मूल्य (सुक्ष्ममापी / पिक्सेल) के साथ चर pix_conv के लिए वर्तमान मूल्य की जगह.
2. फ़ाइल संरचना:
होलिका के लिए अपने डेटा का विश्लेषण के लिए आदेश में, फ़ाइलों को इस विशिष्ट संरचना (चित्रा 2) में आयोजित किया जाना चाहिए. आप होगा:
- एक मास्टर फ़ोल्डर
- उप फ़ोल्डर्स (अपने विभिन्न स्थितियों में से प्रत्येक युक्त)
- सेल छवि फ़ाइलों (filename.tif फ़ाइलें) विभिन्न हालत फ़ोल्डर में निहित
- एक अलाव युक्त होलिका Matlab mfiles फ़ोल्डर (भी मास्टर फ़ोल्डर में निहित)
3. NeuronJ में अनुरेखण न्यूरॉन्स:
- अनुरेखण के लिए छवि तैयार
- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'ओपन' बटन का चयन और छवि आप को ट्रेस करना चाहते हैं का चयन करके छवि खोलो.
- 'को अधिकतम' बटन का चयन करके छवि का आकार बदलें.
- और छवि की चमक, इसके विपरीत समायोजित इतनी है कि आप NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'छवि' तब चयन 'चमक समायोजित / इसके विपरीत' का चयन करके neurites के सभी कल्पना कर सकते हैं.
- NeuronJ सेल शरीर में ट्रेस और '06 प्रकार' होने के रूप में ट्रेस की पहचान
- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'जोड़ें निशान' बटन का चयन करें.
- सेल शरीर की परिधि के आसपास ट्रेस.
- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'लेबल Tracings' बटन का चयन करें.
- ड्रॉपडाउन मेनू अनुरेखण आईडी 'से' N1 'चुनें.
- चुनें 'NeuronJ में टाइप 06': गुण खिड़की और चुनें 'ठीक है'.
- NeuronJ में neurites ट्रेस
- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'जोड़ें निशान' बटन का चयन करें.
- प्रत्येक neurite शाखा के साथ एक का पता लगाने के जोड़ें. आप केवल dendrites या अक्षतंतु अपने प्रयोग के आधार पर चयन कर सकते हैं.
- हम सुझाव है कि आप आकर्षित क्षेत्रों प्रत्येक शाखा बिंदु पर रोक प्रत्येक बेटी शाखा बिंदु एक नया ट्रेस के रूप में उस बिंदु पर शुरू के साथ.
- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'सहेजें Tracings' बटन का चयन करें.
- अनुरेखण सहेजें तुम सिर्फ मूल छवि फ़ाइल के रूप में एक ही फ़ोल्डर में बनाया है.
- NeuronJ से ट्रेस फाइलें और ट्रेस पहचानकर्ता फ़ाइल निर्यात
फ़ाइलों के दो प्रकार NeuronJ से निर्यात किया जाना चाहिए और tif और. NDF फ़ाइलों के साथ उचित हालत फ़ोल्डर्स में सहेजा है.- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'निर्यात ट्रेस' बटन का चयन करें.
- NeuronJ प्रत्येक अनुरेखण 'विकल्प' के लिए अलग फ़ाइल: "टैब deliminated पाठ फ़ाइलों का चयन करें निर्यात 'डायलॉग बॉक्स और चुनें' ठीक है '.
- NeuronJ फ़ाइलें और बचाने के स्थान के नाम को चुनने के लिए अनुमति दें.
- NeuronJ उपकरण पट्टी पर 'उपाय Tracings' बटन का चयन करें.
- खिड़की 'NeuronJ: माप' पर 'प्रदर्शित अनुरेखण माप' विकल्प का चयन करें और चुनें 'भागो'.
- खिड़की: 'Tracings NeuronJ' में 'फ़ाइल' चुनें.
- चुनें 'के रूप में सहेजें' और filen के रूप में फ़ाइल को बचानेame_info. 'फ़ाइलनाम' बिल्कुल मूल छवि फ़ाइल (पूंजीकरण सहित) _info द्वारा पीछा के नाम मैच चाहिए और एक 3 पत्र फ़ाइल एक्सटेंशन शामिल नहीं होना चाहिए. उदाहरण के लिए, मूल छवि नाम Cell20.tif के लिए, इस फ़ाइल 'Cell20_info' का नाम होगा. जाँच करें कि आपके कंप्यूटर को स्वचालित रूप से एक फ़ाइल. Xls एक्सटेंशन जोड़ नहीं है. यदि ऐसा है, तो फ़ाइल एक्सटेंशन मैन्युअल रूप से नष्ट किया जाना चाहिए.
4. NeuronJ डेटा से प्रारंभिक एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें बनाएँ. होलिका का प्रयोग करें:
- 'Bonfire_load' का उपयोग कर फ़ोल्डर्स पुनर्संगठित
- Matlab डबल आइकन पर क्लिक करके खोलें.
- कमांड विंडो के ऊपरी दाएँ में '' बटन पर क्लिक करें.
- 'होलिका' विंडो 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़' में अपने मुख्य फ़ोल्डर में फ़ोल्डर का चयन करें.
- Matlab कमांड खिड़की और प्रेस में प्रकार 'bonfire_load' दर्ज करें.
- हालत फ़ोल्डर है कि आप 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें' विंडो में विश्लेषण करना चाहते हैं और चुनें 'ठीक' चुनें.
- यह प्रत्येक व्यक्ति के कक्ष के लिए डेटा के सभी युक्त उप फ़ोल्डर्स सेल बनाकर फ़ोल्डर संरचना पुनर्निर्माण होगा.
- Filename_prelim.swc bonfire_ndf2swc 'का उपयोग करके फ़ाइलें बनाएँ
- कमांड खिड़की और प्रेस में प्रकार 'bonfire_ndf2swc' दर्ज करें.
- उसी हालत फ़ोल्डर तुम सिर्फ bonfire_load 'के साथ' फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें 'विंडो में पुनर्गठित का चयन करें और चुनें' ठीक है.
- इस चुना हालत के लिए एक प्रत्येक कोशिका फ़ोल्डर में एसडब्ल्यूसी फ़ाइल बनाने जाएगा. अब प्रत्येक कोशिका फ़ोल्डर 5 फाइलें शामिल होंगे, मूल tif छवि, NDF फ़ाइल, _info ट्रेस पहचानकर्ता फ़ाइल, एक txt फ़ाइल और एक एसडब्ल्यूसी फ़ाइल...
5. NeuronStudio प्रयोग करने के लिए अंतिम रूप एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें.
- खोलें और NeuronStudio में न्यूरॉन छवियों जांचना
- NeuronStudio कार्यक्रम खोलें.
- फ़ाइल का चयन करें → NeuronStudio उपकरण पट्टी पर खोलें.
- न्यूरॉन आप संपादित करें और इसे खोलना चाहते हैं. Tif छवि का पता लगाएं.
- → सेटिंग्स का चयन करें चलाने के लिए और '1 Voxel 'साइज विंडो 3 के प्रत्येक (एक्स, वाई, जेड) में बक्से में प्रवेश.
- फ़ाइल का चयन करें → आयात एसडब्ल्यूसी. उपयुक्त. एसडब्ल्यूसी फ़ाइल का चयन करें. छवि फ़ाइल अब एक ट्रेस छवि के साथ मढ़ा जाएगा. सेल सोम एक लाल वृत्त के साथ मढ़ा जाना चाहिए.
- लिंक neurites NeuronStudio का प्रयोग करें
- NeuronStudio में उपकरणों का उपयोग सही ढंग से शाखा अंक और अंत अंक की पहचान (हम अनुशंसा करते हैं कि आप NeuronStudio सुविधाओं और शॉर्टकट के साथ अपने डेटा का विश्लेषण करने से पहले परिचित हो जाते हैं).
- विशेष रूप से, 'neurite उपकरण का उपयोग करें ताकि नोड्स में शामिल होने के लिए:
- प्रत्येक शाखा बिंदु (पीले नोड्स) केवल दो शाखाओं बना सकते हैं
- सभी निशान सोम (केवल एक लाल नोड) के साथ निरंतर कर रहे हैं
- NeuronStudio से डेटा निर्यात
- फ़ाइल → सहेजें neurites (डिफ़ॉल्ट नाम के रूप में बचाने के लिए) का चयन करें.
- में त्रुटियों के लिए जाँच करें. एसडब्ल्यूसी 'bonfire_trace_check' का उपयोग करके फ़ाइलें
- Mathlab कमांड खिड़की और प्रेस में प्रकार 'bonfire_trace_check' दर्ज करें.
- हालत डेटा तुम सिर्फ 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें' विंडो में संसाधित वाले फ़ोल्डर का चयन करें और चुनें 'ठीक है.
- अगर वहाँ किसी भी फ़ोल्डर में छवियों का में कोई त्रुटियाँ हैं कार्यक्रम में प्रदर्शित जहां त्रुटि स्थित है छवियों का उत्पादन होगा.
- NeuronStudio में त्रुटियों फिक्सिंग
- आप निर्यात चरण में बचाया छवि फ़ाइल खोलें.
- पता लगाएँ और समस्या (ओं) को ठीक.
- फ़ाइल क्लिक करें → neurites सहेजें.
- अन्य छवियाँ है कि तय होने की जरूरत के लिए दोहराएँ.
- 'Bonfire_trace_check' (5.4) फिर से दौड़ना.
6. एसडब्ल्यूसी फ़ाइलें से morphological डेटा निकालें. 'अलाव' का प्रयोग करें:
- कमांड खिड़की और प्रेस में प्रकार 'अलाव' दर्ज करें.
- हालत फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें वह डेटा आप 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें' विंडो में विश्लेषण और चुनें 'ठीक' चाहते.
- होलिका विश्लेषण न्यूरॉन्स का विश्लेषण किया जा रहा है, जिसमें यह Sholl विश्लेषण में इस्तेमाल के छल्ले के साथ साथ neuronal आकारिकी रेखांकन में से प्रत्येक के लिए एक खिड़की उत्पन्न होगा. इसके अतिरिक्त, 'अलाव' कमांड. चटाई फ़ाइल है कि रूपात्मक जानकारी है कि विश्लेषण से लिया गया है सभी शामिल उत्पन्न करेगा.
7. 'Bonfire_results' का उपयोग करने के लिए डेटा देखें:
- प्रकार Matlab कमांड विंडो में 'bonfire_results'.
- हालत आप 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें' विंडो में देख सकते हैं और चुनें 'ठीक' करना चाहते हैं के लिए शर्त फ़ोल्डर का चयन करें.
- विंडो 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें' अस्थायी रूप से बंद और फिर से खोलने और, आप अतिरिक्त शर्तों आप देखना चाहते हैं का चयन करने के लिए अनुमति देता है.
- का चयन करें जब आप शर्त फ़ोल्डर्स का चयन करने के लिए खत्म हो रहे हैं, 'रद्द करें' के लिए चयन प्रक्रिया से बाहर निकलने के.
- वें सहित सारांश चार्ट 'Bonfire_results' वापसी करेंगेहालत फ़ोल्डर से ई डेटा आपके द्वारा चयनित.
8. 'Bonfire_export' का उपयोग Excel में डेटा निर्यात:
- कमांड विंडो में टाइप 'bonfire_export'.
- हालत फ़ोल्डर डेटा आप 'फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें' विंडो में निर्यात करना चाहते हैं और चुनें 'ठीक' युक्त चुनें. Bonfire_export morphological डेटा Excel फ़ाइलों को बनाने और उन्हें चुना गया था कि हालत फ़ोल्डर में जगह होगा.
9. प्रतिनिधि परिणाम:
एक डेटा दो शर्तें युक्त सेट पर होलिका कार्यक्रम द्वारा उत्पन्न डेटा का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. इस उदाहरण में, हालत एक न्यूरॉन्स सेल शरीर के लिए बाहर का neurites होते हैं. इस घटना कुल वृक्ष के समान कुंज (चित्रा 3A) की Sholl वक्र में और टर्मिनल अंक (चित्रा 3C) की संख्या के ग्राफ में उदाहरण छवियाँ (3B चित्रा) में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से देखा जा सकता है है . इसके अतिरिक्त, क्योंकि होलिका कार्यक्रम भी छवियों के उपक्षेत्र पर Sholl विश्लेषण करता है, हम और अधिक विशेष रूप से वृद्धि हुई है neurites कि की पहचान करने में सक्षम हैं. दोनों 3 Rd क्रम या अधिक से अधिक neurites (3F चित्रा) और दोनों मध्यस्थ और टर्मिनल neurites की कुल संख्या के चौराहों की कुल संख्या (चित्रा 3 जी) सेल शरीर के लिए बाहर का बढ़ रहे हैं. इन प्रवृत्तियों को भी 3 डी और 3E आंकड़े में मनाया जा सकता है .
चित्रा 1: होलिका कार्यक्रम का फ्लो चार्ट न्यूरॉन्स ImageJ का उपयोग कर पता लगाया जा रहे हैं. डेटा और फिर निर्यात कर रहे हैं प्रारंभिक. एसडब्ल्यूसी फ़ाइलों में होलिका प्रोग्राम द्वारा परिवर्तित. NeuronStudio neurites की कनेक्टिविटी को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. त्रुटियों के लिए होलिका की जाँच और फिर Sholl घटता, प्राथमिक, माध्यमिक और उच्च आदेश neurites की संख्या, और शाखा अंक और neurite सुझावों की संख्या की गणना करता है. अंत में, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा Excel में निर्यात कर रहे हैं.
चित्रा 2: फ़ाइल संरचना होलिका विश्लेषण के लिए आवश्यक फ़ाइल की संरचना से मेल खाना चाहिए या इस कार्यक्रम सही ढंग से नहीं चलेंगे . फ़ोल्डर्स और फ़ाइलें और फ़ोल्डर्स और फ़ाइलों की मात्रा के नाम बदला जा सकता है.
चित्रा 3: उदाहरण होलिका कार्यक्रम से उत्पादन डेटा ए) कुल Sholl घटता. बी) दोनों स्थितियों के उदाहरण छवियों औंधा. सी) शाखा अंक और टर्मिनल अंक / सेल की औसत संख्या. डी), प्राथमिक, माध्यमिक, और तृतीयक या अधिक से अधिक neurites के लिए सेल / प्रक्रियाओं की औसत संख्या. ई) / रूट के लिए सेल, मध्यवर्ती और टर्मिनल neurites प्रक्रियाओं की औसत संख्या. एफ) सेगमेंट पहचान विशिष्ट Sholl विश्लेषण घटता. अनुभाग प्राथमिक, माध्यमिक, या तृतीयक या अधिक से अधिक के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. जी) खंड पहचान विशिष्ट Sholl विश्लेषण घटता. अनुभाग जड़ के क्षेत्रों, मध्यवर्ती क्षेत्रों, या टर्मिनल क्षेत्रों के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं.
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Discussion
होलिका कार्यक्रम dendrite और अक्षतंतु आकारिकी के विश्लेषण के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रोग्राम है. यह बहुत दक्षता और विश्लेषण मैन्युअल प्रदर्शन अधिक Sholl विश्लेषण की सटीकता बढ़ जाती है. इसके अलावा, होलिका कार्यक्रम की प्रक्रिया के हर कदम पर डेटा बचाता है, यह संभव डेटा लेखा परीक्षा करने के लिए और विश्लेषण की सटीकता को सत्यापित करने के लिए बना. इसलिए, डेटा विश्लेषण का कार्य समझौता सटीकता के बिना कई व्यक्तियों को वितरित किया जा सकता है. अन्त में, छवियों के उपक्षेत्र पर विश्लेषण प्रदर्शन करने के द्वारा, कार्यक्रम के लिए स्थानीय शाखाओं में बंटी में परिवर्तन है कि जब Sholl विश्लेषण पूरे dendrite या अक्षतंतु कुंज पर ही चलाया जाता है याद कर रहे हैं की पहचान करने में सक्षम है. हमारे कार्यक्रम कैसे neurites के विशिष्ट सबसेट सेल शरीर के संदर्भ में व्यवस्थित होते हैं की पहचान करने में सक्षम है. एक परिणाम के रूप में, छवियों में शाखाओं में बंटी पैटर्न हैं कि होलिका प्रोग्राम द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं डेटा के द्वारा अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा. आर्थिक सहायता एजेंसियों होलिका के विकास में कोई वैज्ञानिक भूमिका की थी.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में Busch बायोमेडिकल अनुदान, NSF अनुदान आईबीएन 0548543, NSF अनुदान आईबीएन 0919747, मार्च ऑफ डाइम्स फाउंडेशन अनुदान की 1 - FY04-107, मार्च ऑफ डाइम्स फाउंडेशन अनुदान के एक - FY08 464 (BLF के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. MKK और CGL NIH जैव प्रौद्योगिकी प्रशिक्षण अनुदान GM008339 20-T32 द्वारा समर्थित थे, और CGL भी स्पाइनल कॉर्ड अनुसंधान predoctoral फैलोशिप 08-२,९४१ - SCR-E-0 पर एक न्यू जर्सी आयोग द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
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