Summary
We hebben een computerprogramma ontwikkeld om neuronale morfologie te analyseren. In combinatie met de twee bestaande open source analyse-instrumenten, ons programma voert Sholl analyse en bepaalt het aantal neurieten, branche punten en neurieten tips. De analyses zijn zo uitgevoerd dat de lokale veranderingen in de morfologie van neurieten kan worden waargenomen.
Abstract
Neuronale morfologie speelt een belangrijke rol bij het bepalen hoe neuronen functioneren en communiceren 1-3. In het bijzonder, het beïnvloedt het vermogen van neuronen om input te ontvangen van andere cellen 2 en draagt bij aan de verspreiding van actiepotentialen 4,5. De morfologie van de neurieten heeft ook invloed op hoe informatie wordt verwerkt. De diversiteit van de dendriet morfologieën vergemakkelijken lokale en lange afstand signalering en een individuele neuronen of groepen neuronen voor het uitvoeren van gespecialiseerde functies binnen het neuronale netwerk 6,7. Veranderingen in dendriet morfologie, met inbegrip van de versnippering van dendrieten en veranderingen in de vertakking patronen, zijn waargenomen in een aantal van de ziekte staten, waaronder de ziekte van Alzheimer 8, schizofrenie 9,10, en mentale retardatie 11. De mogelijkheid om zowel inzicht in de factoren die dendriet morfologie vorm en op veranderingen in de dendriet morfologie te identificeren is essentieel in het begrijpen van het zenuwstelsel de functie en disfunctie.
Neurieten morfologie wordt vaak geanalyseerd door Sholl analyse en door het tellen van het aantal neurieten en het aantal van de branche tips. Deze analyse is over het algemeen toegepast op de dendrieten, maar het kan ook worden toegepast op axonen. Het uitvoeren van deze analyse met de hand is zowel tijdrovend en onvermijdelijk introduceert variabiliteit te wijten aan experimentator vooringenomenheid en inconsistentie. Het vreugdevuur programma is een semi-geautomatiseerde aanpak voor de analyse van de dendriet en axonen morfologie die voortbouwt op beschikbare open-source morfologische analyse-tools. Ons programma maakt het opsporen van lokale wijzigingen in de dendriet en axon vertakt gedrag door het uitvoeren van Sholl analyse van subregio's van de neuritische prieel. Bijvoorbeeld, is Sholl analyse uitgevoerd op zowel de neuron als geheel als voor elke deelverzameling van processen (primaire, secundaire, terminal, wortel, etc.) Dendrite en axon patroonvorming is beïnvloed door een aantal van intracellulaire en extracellulaire factoren, veel lokaal handelen. Zo, de resulterende morfologie prieel is een gevolg van de specifieke processen die op specifieke neurieten, waardoor het noodzakelijk is om morfologische analyse uitvoeren op een kleinere schaal om deze lokale variaties 12 te observeren.
Het vreugdevuur programma vereist het gebruik van twee open-source analyse-instrumenten, de NeuronJ plugin om ImageJ en NeuronStudio. Neuronen zijn terug te vinden in ImageJ, en NeuronStudio wordt gebruikt om de connectiviteit tussen neurieten definiëren. Bonfire bevat een aantal aangepaste scripts geschreven in MATLAB (MathWorks) die worden gebruikt om de gegevens te converteren naar het juiste formaat voor verdere analyse, kijk voor de gebruiker fouten, en uiteindelijk uit te voeren Sholl analyse. Tot slot worden de gegevens geëxporteerd naar Excel voor statistische analyse. Een stroomschema van de Bonfire programma is weergegeven in figuur 1.
Protocol
1. Voordat u begint:
1) E18 rat dissectie:
Standaard dissectie methoden van E18 hippocampus neuronen eerder beschreven 13. Om het Bonfire-programma te gebruiken om de morfologische kenmerken van de neurieten analyseren, moeten 8 bit. TIF-afbeeldingen van de individuele neuronen worden verkregen. Dit kan worden bereikt op een aantal manieren, afhankelijk van de experimentele protocol dat u volgt. Neuronen kunnen worden uitgeplaat bij een dichtheid laag genoeg zodat de single neuronen in het veld microscoop. Als alternatief, om beeld individuele neuronen die zijn gekweekt in een dichte cultuur, kan neuronen worden getransfecteerd met behulp van een verscheidenheid aan transfectie methoden met een plasmide dat codeert voor een fluorescerend eiwit.
2) Software Eisen en Installatie:
- De NeuronJ plugin voor de ImageJ software van NIH en NeuronStudio moeten beide worden geïnstalleerd om het Bonfire programma uit te voeren. De software pakketten is te vinden op de volgende websites:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - Het vreugdevuur programma is te vinden op http://lifesci.rutgers.edu/ ~ firestein. Het vreugdevuur handleiding is ook beschikbaar op deze website. Bovendien kan de initiële beschrijving van Bonfire te vinden in Langhammer et al., Cytometry 2010. Al onze gegevens werden geanalyseerd met behulp van een Windows-besturingssysteem.
3) Beeldresolutie Aanpassing:
U moet het Bonfire programma gebaseerd op het beeld resolutie van de beelden die u wilt analyseren aan te passen. In de bonfire_parameters deel van het Bonfire-programma, vervangt de huidige waarde voor de variabele pix_conv met de waarde van de beeldresolutie (um / pixel) van uw afbeeldingen.
2. File Structuur:
Om Bonfire om uw gegevens te analyseren, moeten de bestanden worden georganiseerd in deze specifieke structuur (figuur 2). U krijgt:
- Een meester map
- Sub-mappen (met elk van uw verschillende voorwaarden)
- Cel image-bestanden (filename.tif bestanden) die in de andere conditie mappen
- Een Vreugdevuur map met de Bonfire Matlab mfiles (ook opgenomen in de hoofdmap)
3. Tracing Neuronen in NeuronJ:
- Bereid de afbeelding voor het traceren
- Open de afbeelding door het selecteren van de 'Open' knop op de werkbalk NeuronJ en het selecteren van de afbeelding die je wilt op te sporen.
- De grootte van het beeld door het selecteren van de 'maximaliseren' te klikken.
- Pas de helderheid en het contrast van het beeld, zodat u alle van de neurieten visualiseren door het selecteren van 'Afbeelding' op de NeuronJ werkbalk te selecteren 'Pas de helderheid / contrast'.
- Trace de cel lichaam in NeuronJ en identificeren van de sporen als 'Type 06'
- Selecteer de 'Add Traces' knop op de werkbalk NeuronJ.
- Trace rond de omtrek van de cel lichaam.
- Selecteer de 'Label traces' knop op de werkbalk NeuronJ.
- Selecteer 'N1' uit het 'Traceer ID' dropdown menu.
- Selecteer 'Type 06' in het NeuronJ: attributen venster en kies 'OK'.
- Trace van de neurieten in NeuronJ
- Selecteer de 'Add Traces' knop op de werkbalk NeuronJ.
- Voeg een trace langs elke tak van neurieten. U kunt alleen de dendrieten of het axon, afhankelijk van uw experiment.
- Wij stellen voor dat de segmenten u tekent stoppen bij elk filiaal punt, met elk dochter tak punt vanaf dat moment als een nieuwe trace.
- Kies de 'Save traces' knop op de werkbalk NeuronJ.
- Sla de tracing u zojuist hebt gemaakt in dezelfde map als het originele image-bestand.
- Exporteer de trace-bestanden en het trace naam bestand van NeuronJ
Twee soorten bestanden moeten worden geëxporteerd uit NeuronJ en opgeslagen in de juiste conditie folders samen met de. Tif en. NDF-bestanden.- Selecteer de 'Export Trace' knop op de werkbalk NeuronJ.
- Selecteer de "Tab-deliminated text-bestanden: apart bestand voor 'optie op de' elke tracing NeuronJ: Export 'dialoogvenster en selecteer' OK '.
- Laat NeuronJ om de namen van de bestanden en de opslaglocatie te kiezen.
- Selecteer de 'Measure traces' knop op de werkbalk NeuronJ.
- Kies de 'Display tracing metingen' optie op de 'NeuronJ: Maten' venster en selecteer 'Uitvoeren'.
- Kies 'Bestand' in de 'NeuronJ: traces' venster.
- Selecteer 'Opslaan als' en sla het bestand op als filename_info. 'Bestandsnaam' moet exact overeenkomen met de naam van het originele beeld-bestand (inclusief hoofdletters), gevolgd door _info en mag niet bevatten een 3-letter file-extensie. Bijvoorbeeld, voor originele afbeelding naam Cell20.tif, zou dit bestand de naam 'Cell20_info'. Controleer of uw computer niet automatisch een. Xls extensie toe te voegen. Als dat zo is, moet het bestand extensie handmatig worden verwijderd.
4. Gebruik Bonfire om voorlopige SWC bestanden van NeuronJ gegevens Build.:
- Reorganiseren mappen met behulp van 'bonfire_load'
- Open Matlab door te dubbelklikken op het pictogram.
- Klik op de knop 'in de rechterbovenhoek van het commando venster.
- Selecteer de 'Bonfire' map in je hoofdmap in de 'Map' venster.
- Typ 'bonfire_load' in de Matlab command window en druk op enter.
- Selecteer de voorwaarde map die u wilt analyseren in de 'Map' en selecteer 'OK'.
- Dit zal reorganiseren de mapstructuur door het creëren van cel sub-mappen die alle gegevens voor elke individuele cel.
- Maak filename_prelim.swc bestanden met 'bonfire_ndf2swc'
- Typ 'bonfire_ndf2swc' in de command window en druk op enter.
- Selecteer dezelfde aandoening map die u zojuist gereorganiseerd met 'bonfire_load' in de 'Map' en selecteer 'OK'.
- Dit zal een. SWC-bestand in elke cel map voor de gekozen toestand. Elke cel map bevat nu 5 bestanden;. Tif de oorspronkelijke afbeelding, het NDF-bestand, de _info trace naam bestand, een txt-bestand en een SWC-bestand....
5. Gebruik NeuronStudio af te ronden SWC-bestanden.:
- Open en neuron beelden kalibreren in NeuronStudio
- Open het NeuronStudio programma.
- Selecteer Bestand → Openen op de werkbalk NeuronStudio.
- Zoek het. Tif beeld van het neuron die u wilt bewerken en open het.
- Selecteer Uitvoeren → Instellingen en voer '1 'in elk van de drie (X, Y, Z) boxen in het' venster Voxel Size '.
- Selecteer Bestand → Importeren SWC. Selecteer het juiste. SWC-bestand. Het beeldbestand wordt nu bedekt met een trace beeld. De cel soma moet worden bedekt met een rode cirkel.
- Gebruik NeuronStudio te koppelen neurieten
- Gebruik maken van de tools in NeuronStudio om correct te identificeren tak en eindpunten (we raden u kennismaken met NeuronStudio de functies en sneltoetsen voor het analyseren van uw gegevens).
- In het bijzonder, gebruik dan de 'neurieten tool' om te knopen, zodat join:
- Elke tak punt (geel nodes) kan alleen maar leiden tot twee takken
- Alle sporen zijn continu met de soma (slechts een rode knoop)
- Gegevens exporteren uit NeuronStudio
- Selecteer Bestand → Opslaan neurieten (behalve als de standaard naam).
- Controleren op fouten in. SWC-bestanden met behulp van 'bonfire_trace_check'
- Typ 'bonfire_trace_check' in de Mathlab command window en druk op enter.
- Selecteer de voorwaarde map met de gegevens die u zojuist hebt verwerkt in de 'Map' en selecteer 'OK'.
- Als er fouten in een van de afbeeldingen in de map waarin het programma zal de beelden tonen waar de fout zich bevindt.
- Het herstellen van fouten in NeuronStudio
- Open het image-bestand hebt opgeslagen in het uitvoerende stap.
- Lokaliseren en oplossen van het probleem (s).
- Klik op Bestand → Opslaan neurieten.
- Herhaal dit voor andere beelden die moeten worden vastgesteld.
- Herhaling 'bonfire_trace_check' (5,4).
6. Gebruik 'Bonfire' om morfologische gegevens te extraheren uit SWC-bestanden.:
- Typ 'Bonfire' in de command window en druk op enter.
- Selecteer de voorwaarde map met de gegevens die u wilt analyseren in de 'Map' venster en selecteer 'OK' bevat.
- Het vreugdevuur analyse levert een venster voor elk van de neuronen worden geanalyseerd, waarin het de neuronale morfologie grafieken samen met de Sholl ringen gebruikt in de analyse. Daarnaast zal de 'Bonfire' commando genereren. Mat bestand dat alle van de morfologische informatie die is overgenomen uit de analyse bevat.
7. Gebruik 'bonfire_results' om de gegevensweergave:
- Typ 'bonfire_results' in de Matlab command window.
- Selecteer de voorwaarde map voor de aandoening waarvoor u wilt zien in de 'Map' en selecteer 'OK'.
- De 'Map' venster zal tijdelijk sluiten en opnieuw te openen, zodat u aanvullende voorwaarden die u wilt bekijken te selecteren.
- Wanneer u klaar bent met het selecteren van conditie mappen, selecteer 'Annuleren' om de selectie te verlaten.
- 'Bonfire_results' zal terugkeren samenvatting grafieken zoals ee gegevens van de aandoening mappen die u hebt geselecteerd.
8. Gebruik 'bonfire_export' om gegevens te exporteren naar Excel:
- Typ 'bonfire_export' in het commando venster.
- Selecteer de voorwaarde map met de gegevens die u wilt exporteren in de 'Map' en selecteer 'OK'. Bonfire_export zal leiden tot Excel-bestanden van de morfologische gegevens en zal ze in de voorwaarde map die is geselecteerd.
9. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van de gegevens die worden gegenereerd door het Bonfire programma op een data-set met twee voorwaarden wordt weergegeven in figuur 3. In dit voorbeeld Voorwaarde 1 neuronen bevatten meer neurieten distaal van het lichaam. Dit fenomeen kan worden waargenomen in het voorbeeld beelden (Figuur 3B), alsmede in de Sholl curve van de totale dendritische Arbor (figuur 3A) en in de grafiek van het aantal eindpunten (Figuur 3C). Bovendien, omdat het Bonfire programma ook Sholl analyse uitvoert op subregio's van de beelden, zijn we in staat om meer specifiek de identiteit van de neurieten die zijn toegenomen. Zowel het totale aantal kruispunten van de 3 e orde of hoger neurieten (figuur 3F) en het totale aantal van zowel de intermediair en terminal neurieten (figuur 3G) worden verhoogd distaal van het lichaam. Deze trends kunnen ook worden waargenomen in de figuren 3D en 3E.
Figuur 1:. Stroomdiagram van het Bonfire programma Neuronen zijn opgespoord met behulp van ImageJ. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd en omgezet door het Bonfire programma in voorlopig. SWC-bestanden. NeuronStudio wordt gebruikt om de connectiviteit van de neurieten te definiëren. Vreugdevuur op fouten wordt gecontroleerd en berekent vervolgens Sholl bochten, het aantal primaire, secundaire en hogere orde neurieten, en het aantal tak punten en neurieten tips. Ten slotte worden de gegevens geëxporteerd naar Excel voor statistische analyse.
Figuur 2: File structuur die nodig is voor Bonfire analyse De file structuur moet overeenkomen met dit of het programma wordt niet correct uitgevoerd.. De namen van de mappen en bestanden en de hoeveelheid van de mappen en bestanden kunnen worden gewijzigd.
Figuur 3: Voorbeeld uitvoergegevens van Bonfire programma A) Totaal Sholl bochten.. B) Voorbeeld omgekeerde beelden van beide voorwaarden. C) Gemiddeld aantal tak punten en eindpunten / cel. D) Gemiddeld aantal processen / cel voor primaire, secundaire en tertiaire of hoger neurieten. E) Gemiddeld aantal processen / cel voor root, intermediate, en terminal neurieten. F) Segment identiteit-specifieke Sholl analyse bochten. Segmenten zijn gegroepeerd als primaire, secundaire of tertiaire of hoger. G) Segment identiteit-specifieke Sholl analyse bochten. Segmenten zijn gegroepeerd als root segmenten, tussenliggende segmenten, of terminal segmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vreugdevuur programma is een semi-geautomatiseerd programma voor de analyse van dendriet en axonen morfologie. Het vergroot de efficiency en de nauwkeurigheid van Sholl analyse over het uitvoeren van de analyse handmatig. Daarnaast is het Bonfire programma slaat de gegevens op elke stap van het proces, waardoor het mogelijk is om de gegevens te controleren en om de juistheid van de analyse te verifiëren. Daarom kan de taak van de data-analyse worden uitgedeeld aan een groot aantal individuen zonder afbreuk te doen aan nauwkeurigheid. Ten slotte, door het uitvoeren van de analyse van subregio's van de beelden, het programma is in staat om lokale veranderingen in de vertakking die worden gemist wanneer Sholl analyse is alleen uitgevoerd op de gehele dendriet of axon prieel te identificeren. Ons programma is in staat om te bepalen hoe specifieke subsets van neurieten zijn gerangschikt in verwijzing naar de cel lichaam. Als gevolg hiervan zijn de vertakking patronen in de foto's goed vertegenwoordigd door de gegevens die worden gegenereerd door het programma Bonfire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. De financiers hadden geen wetenschappelijke rol in de ontwikkeling van Bonfire.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door een Busch Biomedical Grant, NSF verlenen IBN-0548543, NSF verlenen IBN-0919747, March of Dimes Foundation Grant een-FY04-107, March of Dimes Foundation Grant een-FY08-464 (tot BLF). MKK en CGL werden gesteund door NIH Biotechnology Training Grant T32 GM008339-20, en CGL werd ook ondersteund door een NJ Commissie over Spinal Cord Research Predoctorale Fellowship 08-2941-SCR-E-0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
