Summary
Vi har utvecklat ett datorprogram för att analysera neuronal morfologi. I kombination med två befintliga öppen källkod analys, utför vårt program Sholl analys och fastställer antalet neurites, förgreningar och tips neurite. Analyserna utförs så att lokala förändringar i neurite morfologi kan observeras.
Abstract
Neuronal morfologi spelar en betydande roll för hur nervceller fungerar och kommunicerar 1-3. Närmare bestämt, det påverkar möjligheterna för nervceller att få input från andra celler 2 och bidrar till spridning av aktionspotentialen 4,5. Den morfologi neurites påverkar också hur informationen behandlas. Mångfalden av Dendrite morfologier underlätta lokala och långväga signalering och tillåta enskilda nervceller eller grupper av nervceller för att utföra specialiserade funktioner inom det neuronala nätverket 6,7. Förändringar i Dendrite morfologi, inklusive fragmentering av dendriter och förändringar i förgrening mönster har observerats i ett antal sjukdomstillstånd, inklusive Alzheimers sjukdom 8, schizofreni 9,10 och mental retardation 11. Förmågan att både förstå de faktorer som formar Dendrite morfologier och att identifiera förändringar i Dendrite morfologier är viktigt att förstå nervsystemets funktion och dysfunktion.
Neurite morfologi är ofta analyseras av Sholl analys och genom att räkna antalet neurites och antalet grenen tips. Denna analys är i allmänhet tillämpas på dendriter, men det kan också tillämpas på axoner. Utföra denna analys för hand är både tidskrävande och oundvikligen introducerar variationer på grund av försöksledaren partiskhet och inkonsekvens. Det Bonfire Programmet är en semi-automatiserad metod för analys av Dendrite och axon morfologi som bygger på tillgänglig öppen källkod morfologisk analys verktyg. Vårt program gör det möjligt att upptäcka lokala förändringar i Dendrite och axon förgrening beteenden genom att utföra Sholl analys underregioner av neuritic berså. Till exempel är Sholl analys på både neuron som helhet samt för varje delmängd av processer (grundskola, gymnasium, terminal, rot, etc.) Dendrite och Axon mönster påverkas av ett antal intracellulära och extracellulära faktorer, många agerar lokalt. Således är det resulterande bersån morfologi till följd av specifika processer som verkar på specifika neurites, vilket gör det nödvändigt att utföra morfologisk analys i mindre skala för att observera dessa lokala variationer 12.
Det Bonfire Programmet kräver användning av två öppen källkod analys samt NeuronJ plugin för att ImageJ och NeuronStudio. Nervceller spåras i ImageJ och NeuronStudio används för att definiera de förbindelser mellan neurites. Brasa innehåller ett antal egna skript skrivna i MATLAB (The MathWorks) som används för att konvertera data till lämpligt format för vidare analys, kontrollera om användaren fel, och slutligen utföra Sholl analys. Slutligen finns data exporteras till Excel för statistisk analys. Ett flödesschema för Bonfire programmet visas i figur 1.
Protocol
1. Innan du börjar:
1) E18 råtta dissektion:
Standard dissekeringsmetoder av E18 hippocampus nervceller har tidigare beskrivits 13. För att kunna använda Bonfire för att analysera de morfologiska egenskaper neurites måste 8 bit. Tif bilder av enskilda nervceller erhållas. Detta kan göras på flera sätt beroende på försöksprotokoll du följer. Nervceller kan vara klädd på ett tillräckligt låg densitet så att enskilda nervceller visas i mikroskop området. Alternativt, för att avbilda enskilda nervceller som odlas i en tät kultur kan nervceller vara transfekterade med hjälp av olika transfektion metoder med en plasmid som kodar för ett fluorescerande protein.
2) Programvara och installation:
- Den NeuronJ plugin för ImageJ programvara från NIH och NeuronStudio måste båda vara installerade för att köra Bonfire programmet. Programvaran förpackningar finns på följande webbplatser:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - Det Bonfire Programmet kan hittas på http://lifesci.rutgers.edu/ ~ firestein. Den Bonfire bruksanvisning finns också tillgänglig på denna webbplats. Dessutom kan den inledande beskrivningen av Bonfire hittas i Langhammer et al, Cytometry 2010. Alla våra data har analyserats med hjälp av ett Windows-operativsystem.
3) Bildupplösning justering:
Du kommer att behöva justera Bonfire program baserat på den upplösning av de bilder som du vill analysera. I bonfire_parameters delen av Bonfire programmet, ersätta det nuvarande värdet för variabeln pix_conv med värdet av bildupplösning (Öm / pixel) av dina bilder.
2. Filstruktur:
För Bonfire att analysera dina data, måste filerna vara organiserad i detta specifika struktur (figur 2). Du kommer att ha:
- En mästare mapp
- Undermappar (som innehåller alla dina olika förhållanden)
- Cell bildfiler (filename.tif filer) som finns i olika skick mappar
- En brasa mapp som innehåller Bonfire Matlab mfiles (finns även i master mappen)
3. Spåra nervceller i NeuronJ:
- Förbered bilden för att spåra
- Öppna bilden genom att välja "Öppna"-knappen på NeuronJ verktygsfältet och välja den bild du vill spåra.
- Ändra storlek på bilden genom att välja "maximera" knappen.
- Justera ljusstyrka och kontrast i bilden så att du kan visualisera alla neurites genom att välja "Image" på NeuronJ verktygsfältet sedan välja "Justera ljusstyrka / kontrast".
- Trace cellkroppen i NeuronJ och identifiera spår som "typ 06"
- Välj "Lägg Spår"-knappen på NeuronJ verktygsfältet.
- Trace runt utkanten av cellkroppen.
- Välj "Label tracings"-knappen på NeuronJ verktygsfältet.
- Välj "N1" från "Tracing ID" rullgardinsmenyn.
- Välj "Typ 06" i NeuronJ: Attribut fönstret och välj "OK".
- Spåra neurites i NeuronJ
- Välj "Lägg Spår"-knappen på NeuronJ verktygsfältet.
- Lägg till ett spår längs varje neurite gren. Du kan välja bara dendriter eller axon, beroende på experimentet.
- Vi föreslår att de segment du ritar stanna vid varje gren punkt, där varje dotter gren punkt med början på den punkten som en ny spår.
- Välj "Spara tracings"-knappen på NeuronJ verktygsfältet.
- Spara spåra du just har skapat i samma mapp som den ursprungliga bildfilen.
- Exportera spår filer och spår ID-filen från NeuronJ
Två typer av filer måste exporteras från NeuronJ och sparas i lämpligt tillstånd mappar tillsammans med. Tif och. NDF-filer.- Välj "Export Trace"-knappen på NeuronJ verktygsfältet.
- Välj "Tab-deliminated text-filer: separat fil för varje spåra" alternativet på "NeuronJ: Export" dialogrutan och välj "OK".
- Låt NeuronJ att välja namn på filerna och spara plats.
- Välj "Mät tracings"-knappen på NeuronJ verktygsfältet.
- Välj "Visa spårning mätningar" alternativet på "NeuronJ: Mått" fönstret och välj "Kör".
- Välj "File" i "NeuronJ: tracings" fönster.
- Välj "Spara som" och spara filen som Filéname_info. "Filnamn" måste exakt matcha namnet på den ursprungliga bildfilen (inklusive kapitalisering) följt av _info och bör inte innehålla en 3-brev file-extension. Till exempel för originalbilden namn Cell20.tif, skulle den här filen få namnet "Cell20_info". Kontrollera att din dator inte automatiskt lägga till en. Xls-fil förlängning. Om den gör det, måste filändelsen raderas manuellt.
4. Använd Bonfire att bygga Preliminära SWC filer från NeuronJ Data.:
- Omorganisera mappar med "bonfire_load"
- Öppna Matlab genom att dubbelklicka på ikonen.
- Klicka på knappen '' i övre högra hörnet av kommandofönstret.
- Välj "Bonfire" mappen i din herre mappen i "Bläddra efter mapp" fönstret.
- Skriv "bonfire_load" i Matlab kommandofönstret och tryck enter.
- Markera villkoret mapp som du vill analysera i "Bläddra efter mapp" fönstret och välj "OK".
- Detta kommer att omorganisera mappstrukturen genom att skapa cell undermappar som innehåller alla data för varje enskild cell.
- Skapa filename_prelim.swc filer med "bonfire_ndf2swc"
- Skriv "bonfire_ndf2swc" i kommandofönstret och tryck enter.
- Välj samma skick mapp du just omorganiserats med 'bonfire_load "i" Bläddra efter mapp "fönstret och välj" OK ".
- Detta kommer att skapa ett. SWC-fil i varje cell mappen för den valda villkoret. Varje cell mappen nu innehålla 5 filer,. Ursprungliga TIF-bild, NDF filen, _info spår ID-fil, en txt-fil och en SWC-fil....
5. Använd NeuronStudio att slutföra SWC-filer.:
- Öppna och kalibrera neuron bilder i NeuronStudio
- Öppna NeuronStudio programmet.
- Välj Arkiv → Öppna på NeuronStudio verktygsfältet.
- Hitta den. TIF-bild av neuron du vill redigera och öppna det.
- Välj Kör → Inställningar och ange 1 "i varje av de 3 (X, Y, Z) lådor i" Voxel Size "fönstret.
- Välj Arkiv → Importera SWC. Välj lämplig. SWC-fil. Bildfilen kommer nu att överdragen med ett spår bild. Cellen soma ska vara belagd med en röd cirkel.
- Använd NeuronStudio länka neurites
- Använd verktygen i NeuronStudio att korrekt identifiera gren och slutpunkter (vi rekommenderar att du stifta bekantskap med NeuronStudio funktioner och genvägar innan analysera dina data).
- Specifikt använda "neurite verktyg" för att ansluta noder så att:
- Varje gren punkt (gul noder) kan bara skapa två grenar
- Alla spår är kontinuerlig med Soma (endast en röd nod)
- Exportera data från NeuronStudio
- Välj Arkiv → Spara neurites (spara som standard namnet).
- Kontrollera om fel i. SWC-filer med hjälp av "bonfire_trace_check"
- Skriv "bonfire_trace_check" i Mathlab kommandofönstret och tryck enter.
- Markera villkoret mapp som innehåller de data som du just har behandlats i "Bläddra efter mapp" fönstret och välj "OK".
- Om det finns några fel i någon av bilderna i den mapp programmet kommer ut bilder som visar var felet ligger.
- Fastställande fel i NeuronStudio
- Öppna den bildfil du sparade i den exporterande steg.
- Lokalisera och åtgärda problemet (s).
- Klicka på Arkiv → Spara neurites.
- Upprepa för andra bilder som behöver rättas till.
- Kör "bonfire_trace_check" (5,4).
6. Använd "brasa" Extrahera Morfologiska data från SWC-filer.:
- Skriv "brasa" i kommandofönstret och tryck enter.
- Markera villkoret mapp som innehåller de data du vill analysera i "Bläddra efter mapp" fönstret och välj "OK".
- Den Bonfire Analysen kommer att generera ett fönster för varje av de nervceller som analyseras, i vilken den grafer den neuronala morfologi tillsammans med Sholl ringarna används i analysen. Dessutom kommer "bål" kommandot genererar. Mattan fil som innehåller alla de morfologiska uppgifter som har hämtats från analysen.
7. Använd 'bonfire_results "för att visa data:
- Skriv "bonfire_results" i Matlab kommando fönstret.
- Markera villkoret mapp för de villkor som du vill visa i "Bläddra efter mapp" fönstret och välj "OK".
- Den "Välj mapp" fönstret stängs tillfälligt och åter öppna, där du kan välja ytterligare villkor som du vill visa.
- När du är klar med att välja tillstånd mappar väljer du "Avbryt" för att avsluta urvalsprocessen.
- "Bonfire_results" kommer tillbaka sammanfattande diagram, inklusive: ee uppgifter från villkoret mappar du valt.
8. Använd 'bonfire_export "för att exportera data till Excel:
- Skriv "bonfire_export" i kommandofönstret.
- Markera villkoret mapp som innehåller de data du vill exportera i "Bläddra efter mapp" fönstret och välj "OK". Bonfire_export kommer att skapa Excel-filer av morfologiska data och placera dem i det skick mapp som valdes.
9. Representativa resultat:
Ett exempel på data som genereras av Bonfire programmet på en datamängd som innehåller två villkor visas i figur 3. I detta exempel Skick 1 nervceller innehålla mer neurites distalt cellkroppen. Detta fenomen kan observeras i exemplet bilderna (Figur 3B) samt i Sholl kurvan av den totala dendritiska bersån (Figur 3A) och grafen av antalet terminalen poäng (figur 3C). Dessutom, eftersom Bonfire programmet även utför Sholl analys på underregioner av bilderna kan vi identifiera mer specifikt identitet neurites som har ökat. Både det totala antalet korsningar på 3: e ordning eller större neurites (Figur 3F) och det totala antalet såväl mellanhand och neurites terminalen (Figur 3G) ökar distalt cellkroppen. Dessa trender kan observeras i figur 3d och 3e.
Figur 1:. Flödesschema för Bonfire programmet nervceller är spåras med hjälp av ImageJ. Uppgifterna exporteras sedan och omvandlas av Bonfire programmet till preliminära. SWC-filer. NeuronStudio används för att definiera anslutning av neurites. Bonfire kontroller för fel och sedan beräknar Sholl kurvor, antalet grundskola, gymnasieskola och högre ordning neurites, och antalet filialer poäng och neurite tips. Slutligen är de data som exporteras till Excel för statistisk analys.
Figur 2: Filstruktur krävs för Bonfire analys Filstrukturen måste matcha denna eller programmet kommer inte att fungera korrekt.. Namnen på mappar och filer och mängden av mappar och filer kan ändras.
Figur 3: Exempel på utdata från Bonfire program A) Totalt Sholl kurvor.. B) Exempel inverterade bilder av båda villkoren. C) Genomsnittligt antal filialer punkter och punkter terminaler / cell. D) Genomsnittligt antal processer / cell för primär, sekundär och tertiär eller större neurites. E) Genomsnittligt antal processer / cell för root, mellan-och neurites terminalen. F) Segment identitet specifika Sholl analys kurvor. Segmenten är grupperade som primär, sekundär eller tertiär eller större. G) Segment identitet specifika Sholl analys kurvor. Segmenten är grupperade som root segment, mellanliggande segment, eller segment terminal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det Bonfire Programmet är ett semi-automatiserat program för analys av Dendrite och Axon morfologi. Det ökar kraftigt effektiviteten och precisionen i Sholl analys över som utför analysen manuellt. Dessutom sparar Bonfire programmet de data vid varje steg i processen, vilket gör det möjligt att granska uppgifterna och att kontrollera riktigheten av analysen. Därför kan uppgiften att dataanalysen delas ut till många personer utan att kompromissa noggrannhet. Slutligen genom att utföra analysen på delområden av bilderna är programmet kunna identifiera lokala förändringar i förgreningen som missade när Sholl analysen körs endast på hela Dendrite eller Axon berså. Vårt program kan identifiera hur specifika delmängder av neurites är ordnade i förhållande till cellkroppen. Som ett resultat är de förgrenade mönster i bilderna väl representeras av de data som genereras av Bonfire programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen konkurrerande intressen. Den finansiärerna hade inga vetenskapliga roll i utvecklingen av Bonfire.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av en Busch biomedicinsk Grant, NSF bevilja Ibn-0548543, NSF bevilja Ibn-0919747, March of Dimes Foundation 1-FY04-107, March of Dimes Foundation 1-FY08-464 (till BLF). MKK och CGL stöddes av NIH bioteknik Training Grant T32 GM008339-20, och CGL stöddes också av en NJ kommission för ryggmärg forskning Predoctoral Fellowship 08-2941-SCR-E-0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
