Summary
Nous avons développé un programme informatique pour analyser la morphologie des neurones. En combinaison avec deux ouverts existants des outils d'analyse de source, notre programme effectue une analyse Sholl et détermine le nombre de neurites, points de branchement, et des conseils neurites. Les analyses sont effectuées de telle sorte que les modifications locales dans la morphologie des neurites peut être observée.
Abstract
Morphologie neuronale joue un rôle important dans la détermination de fonctionnement des neurones et communiquer 1-3. Plus précisément, elle affecte la capacité des neurones à recevoir les contributions des autres cellules 2 et contribue à la propagation des potentiels d'action 4,5. La morphologie des neurites affecte également la manière dont l'information est traitée. La diversité des morphologies dendrites facilitent la signalisation portée locale et long terme et permettent aux neurones individuels ou de groupes de neurones pour effectuer des fonctions spécialisées au sein du réseau neuronal 6,7. Altérations de la morphologie des dendrites, notamment la fragmentation des dendrites et des changements dans la ramification des motifs, ont été observées dans un certain nombre d'états pathologiques, y compris la maladie d'Alzheimer 8, la schizophrénie 9,10, et un retard mental 11. La capacité à la fois de comprendre les facteurs qui façonnent la morphologie des dendrites et d'identifier les changements dans la morphologie des dendrites est essentielle dans la compréhension du fonctionnement du système nerveux et de dysfonctionnement.
La morphologie des neurites est souvent analysée par analyse Sholl et en comptant le nombre de neurites et le nombre d'extrémités de branches. Cette analyse est généralement appliquée aux dendrites, mais il peut également être appliquée à des axones. L'exécution de cette analyse par la main prend du temps et des fois introduit inévitablement variabilité due à un biais expérimentateur et l'incohérence. Le programme de Bonfire est une approche semi-automatisé pour l'analyse de la morphologie des dendrites et des axones qui s'appuie sur disposition open-source des outils d'analyse morphologique. Notre programme permet de détecter des variations locales de dendrite et axone branchement comportements en effectuant des analyses sur les sous-régions Sholl de la tonnelle neuritique. Par exemple, l'analyse est effectuée sur Sholl fois le neurone comme un tout, ainsi que sur chaque sous-ensemble des processus (primaires, secondaires, terminaux, des racines, etc) Dendrite et la structuration axone est influencée par un certain nombre de facteurs intracellulaires et extracellulaires, de nombreux agir localement. Ainsi, la morphologie tonnelle qui en résulte est une suite de processus spécifiques agissant sur neurites spécifiques, ce qui rend nécessaire d'effectuer une analyse morphologique sur une plus petite échelle, afin d'observer ces variations locales 12.
Le programme de Bonfire nécessite l'utilisation de deux outils d'analyse open-source, le plugin pour ImageJ et NeuronJ NeuronStudio. Les neurones sont tracées dans ImageJ, et NeuronStudio est utilisé pour définir la connectivité entre les neurites. Bonfire contient un certain nombre de scripts personnalisés écrits dans MATLAB (The MathWorks) qui sont utilisés pour convertir les données dans le format approprié pour une analyse plus approfondie, vérifier les erreurs d'utilisateur, et, finalement, effectuer une analyse Sholl. Enfin, les données sont exportées vers Excel pour l'analyse statistique. Un organigramme du programme de Bonfire est montré dans la figure 1.
Protocol
1. Avant de commencer:
1) la dissection du rat E18:
Méthodes de dissection standard des neurones de l'hippocampe E18 ont déjà été décrits 13. Afin d'utiliser le programme Bonfire pour analyser les caractéristiques morphologiques des neurites, 8 bits. Images tif de neurones individuels doivent être obtenues. Ceci peut être accompli dans un certain nombre de façons, selon le protocole expérimental que vous suivez. Les neurones peuvent être étalées à une densité assez faible pour que les neurones simples apparaissent dans le champ du microscope. Sinon, pour les neurones image individuelle qui sont cultivées dans une culture dense, les neurones peuvent être transfectées en utilisant une variété de méthodes de transfection avec un plasmide codant pour une protéine fluorescente.
Logiciels requis 2) et d'installation:
- Le plugin NeuronJ pour le logiciel ImageJ du NIH et NeuronStudio doivent tous deux être installés afin d'exécuter le programme de Bonfire. Les packs logiciels peuvent être trouvés sur les sites suivants:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - Le programme de Bonfire se trouve à l'http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. Le manuel de l'utilisateur Bonfire est également disponible sur ce site. En outre, la description initiale de Bonfire peuvent être trouvés dans Langhammer et al, cytométrie en 2010. Toutes nos données ont été analysées en utilisant un système d'exploitation Windows.
3) Ajustement Résolution d'image:
Vous aurez besoin d'ajuster le programme de Bonfire basé sur la résolution d'image de l'image que vous souhaitez analyser. Dans la partie du programme bonfire_parameters Bonfire, remplacez la valeur actuelle de la pix_conv variable avec la valeur de la résolution de l'image (um / pixel) de vos images.
2. Structure du dossier:
Pour Bonfire pour analyser vos données, les fichiers doivent être organisées dans cette structure spécifique (figure 2). Vous devrez:
- Un dossier maître
- Les sous-dossiers (contenant chacun de vos conditions différentes)
- Fichiers d'image cellulaire (fichiers filename.tif) contenus dans les dossiers condition différente
- Un dossier contenant les Bonfire Bonfire Matlab mfiles (également contenus dans le dossier maître)
3. Neurones de traçage dans NeuronJ:
- Préparer l'image pour le traçage
- Ouvrez l'image en sélectionnant le bouton «Ouvrir» dans la barre NeuronJ et en sélectionnant l'image que vous souhaitez tracer.
- Redimensionner l'image en sélectionnant le «maximiser» le bouton.
- Réglez la luminosité et le contraste de l'image afin que vous pouvez visualiser l'ensemble des neurites en sélectionnant 'Image' sur la barre d'outils NeuronJ puis en sélectionnant «Réglage de la luminosité / contraste".
- Trace du corps cellulaire dans NeuronJ et d'identifier la trace comme étant «de type 06 '
- Sélectionnez le bouton «Ajouter des traces sur la barre d'outils NeuronJ.
- Trace le pourtour du corps cellulaire.
- Sélectionnez le bouton «Tracés étiquette» sur la barre d'outils NeuronJ.
- Sélectionnez «N1» du «traçage ID" menu déroulant.
- Sélectionnez "Type 06" dans le NeuronJ: Attributs de fenêtre et choisissez «OK».
- Trace les neurites en NeuronJ
- Sélectionnez le bouton «Ajouter des traces sur la barre d'outils NeuronJ.
- Ajouter une trace le long de chaque branche de neurites. Vous pouvez sélectionner uniquement les dendrites ou de l'axone, selon votre expérience.
- Nous suggérons que les segments vous dessinez arrêt à chaque point de la branche, avec chaque point de ramification fille à partir de ce point comme une nouvelle trace.
- Sélectionnez le bouton 'Enregistrer tracés sur la barre d'outils NeuronJ.
- Enregistrer le tracé que vous venez de créer dans le même dossier que le fichier image d'origine.
- Exportez les fichiers de trace et le fichier d'identification de traces d'NeuronJ
Deux types de fichiers doivent être exportés à partir NeuronJ et enregistré dans les dossiers condition appropriée avec le. Tif et les fichiers sdf..- Sélectionnez le bouton "Exporter Trace» sur la barre d'outils NeuronJ.
- Sélectionnez l'onglet «texte-deliminated fichiers: fichier séparé pour 'option sur la« traçabilité de chaque NeuronJ: Export' boîte de dialogue et sélectionnez «OK».
- Autoriser NeuronJ de choisir les noms des fichiers et l'emplacement de sauvegarde.
- Sélectionnez le bouton «Tracés Mesure» sur la barre d'outils NeuronJ.
- Sélectionnez l'option «Afficher les mesures de traçage» sur le «NeuronJ: Mesures« fenêtre et sélectionner "Exécuter".
- Sélectionnez "Fichier" dans la "NeuronJ: tracés" fenêtre.
- Sélectionnez «Enregistrer sous» et sauvegardez le fichier que Filename_info. 'Filename' doit correspondre exactement au nom du fichier de l'image originale (y compris la capitalisation) suivie par _info et ne doivent pas contenir une lettre de 3-extension de fichier. Par exemple, pour l'image Cell20.tif nom d'origine, ce fichier serait nommé 'Cell20_info ». Vérifiez que votre ordinateur ne dispose pas d'ajouter automatiquement une extension de fichier. Xls. Si c'est le cas, l'extension du fichier doit être supprimé manuellement.
4. Utilisez Bonfire pour construire préliminaires à partir des données des fichiers SWC NeuronJ.:
- Réorganiser des dossiers en utilisant 'bonfire_load'
- Ouvrez Matlab en double-cliquant sur l'icône.
- Cliquez sur le bouton '"en haut à droite de la fenêtre de commande.
- Sélectionnez le 'Bonfire' dossier dans votre dossier maître dans la "Rechercher un dossier" fenêtre.
- Type 'bonfire_load »dans la fenêtre de commande Matlab et appuyez sur ENTRÉE.
- Sélectionnez le dossier à condition que vous souhaitez analyser dans le «Browse For Folder" fenêtre et choisissez «OK».
- Ce sera de réorganiser la structure du dossier en créant des cellules des sous-dossiers contenant toutes les données pour chaque cellule individuelle.
- Créez des fichiers en utilisant filename_prelim.swc 'bonfire_ndf2swc'
- «Bonfire_ndf2swc« taper dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée.
- Sélectionnez le dossier que vous venez de la condition même réorganisé avec 'bonfire_load' dans le 'Browse For Folder "fenêtre et choisissez« OK ».
- Cela va créer un fichier. Swc dans chaque dossier de cellules pour la condition choisie. Chaque dossier de cellule contient maintenant 5 fichiers;. L'image originale tif, le fichier sdf, le fichier de trace _info identifiant, un fichier txt et un fichier SWC....
5. Utilisez NeuronStudio pour finaliser les fichiers SWC.:
- Ouvrir et calibrer les images neurone dans NeuronStudio
- Ouvrez le programme NeuronStudio.
- Sélectionnez Fichier → Ouvrir la barre d'outils NeuronStudio.
- Trouvez l'image. Tif du neurone que vous voulez modifier et ouvrez-le.
- Sélectionnez Exécuter et entrez → Paramètres '1 'dans chacune des 3 (X, Y, Z) cases dans la fenêtre' taille de voxel ».
- Sélectionnez Fichier → Importer CFC. Sélectionnez le fichier approprié. Swc. Le fichier image sera désormais recouvert d'une image de trace. Le corps cellulaire devrait être recouvert d'un cercle rouge.
- Utilisez NeuronStudio aux neurites lien
- Utiliser les outils de NeuronStudio d'identifier correctement les points de ramification et de points d'extrémité (nous vous recommandons de se familiariser avec les caractéristiques NeuronStudio et raccourcis avant d'analyser vos données).
- Plus précisément, l'utilisation du «outil neurites d'adhérer à des nœuds de sorte que:
- Chaque point de ramification (nœuds jaune) ne peut créer que deux branches
- Toutes les traces sont continues avec le soma (un seul nœud rouge)
- Exporter des données de NeuronStudio
- Sélectionnez Fichier → Enregistrer neurites (enregistrer sous le nom par défaut).
- Vérifiez les erreurs dans les fichiers. Swc utilisant 'bonfire_trace_check'
- «Bonfire_trace_check« taper dans la fenêtre de commande Matlab et appuyez sur Entrée.
- Sélectionnez le dossier contenant l'état des données que vous venez de traiter dans le «Browse For Folder" fenêtre et choisissez «OK».
- S'il ya des erreurs dans l'une des images dans le dossier, le programme de sortie des images montrant où se situe l'erreur.
- Correction des erreurs dans les NeuronStudio
- Ouvrez le fichier image que vous avez enregistré à l'étape exportation.
- Localiser et résoudre le problème (s).
- Cliquez sur Fichier → Enregistrer neurites.
- Répétez l'opération pour d'autres images qui doivent être fixes.
- Relancer 'bonfire_trace_check' (5,4).
6. Utilisez «feu de joie" pour extraire des données morphologiques à partir des fichiers SWC.:
- "Feu de joie" taper dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée.
- Sélectionnez le dossier état qui contient les données que vous souhaitez analyser dans le «Browse For Folder" fenêtre et choisissez «OK».
- L'analyse Bûcher va générer une fenêtre pour chacun des neurones en cours d'analyse, dans laquelle elle graphiques de la morphologie neuronale avec les anneaux Sholl utilisées dans l'analyse. De plus, la commande 'feu de joie »va générer le fichier. Matelas qui contient toutes les informations morphologiques qui ont été prises à partir de l'analyse.
7. Utilisez 'bonfire_results' pour afficher les données:
- Type 'bonfire_results »dans la fenêtre de commande Matlab.
- Sélectionnez le dossier condition pour la condition que vous voulez voir dans le «Browse For Folder" fenêtre et choisissez «OK».
- Le «Rechercher un dossier" fenêtre se fermera temporairement et re-ouvert, vous permettant de sélectionner des conditions supplémentaires que vous aimeriez voir.
- Lorsque vous avez terminé la sélection des dossiers condition, sélectionnez «Annuler» pour quitter le processus de sélection.
- «Bonfire_results 'sera de retour tableaux récapitulatifs, y compris ede données électronique de l'état des dossiers que vous avez sélectionnée.
8. Utilisez 'bonfire_export »pour exporter des données vers Excel:
- Type 'bonfire_export »dans la fenêtre de commande.
- Sélectionnez le dossier contenant la condition des données que vous souhaitez exporter dans le «Browse For Folder" fenêtre et choisissez «OK». Bonfire_export créera des fichiers Excel des données morphologiques et les placer dans le dossier la condition qui a été sélectionné.
9. Les résultats représentatifs:
Un exemple des données générées par le programme Bonfire sur un ensemble de données contenant deux conditions est représenté dans la figure 3. Dans cet exemple, la condition 1 neurones contiennent plus de neurites distale vers le corps cellulaire. Ce phénomène peut être observé dans les images par exemple (figure 3B), ainsi que dans la courbe de l'Sholl dendritiques totale Arbor (figure 3A) et dans le graphe du nombre de points terminaux (figure 3C). De plus, parce que le programme effectue également des analyses Bonfire Sholl le sous-régions de l'image, nous sommes en mesure d'identifier plus précisément l'identité des neurites qui ont augmenté. Tant le nombre total d'intersections de 3 e degré ou plus neurites (figure 3F) et le nombre total de fois intermédiaire et neurites terminal (Figure 3G) sont augmentés distale vers le corps cellulaire. Ces tendances peuvent aussi être observés dans les figures 3D et 3E.
Figure 1:. Organigramme du programme de Bonfire neurones sont tracées à l'aide d'ImageJ. Les données sont ensuite exportés et converties par le programme Bonfire en préliminaire. Fichiers SWC. NeuronStudio est utilisé pour définir la connectivité des neurites. Bonfire chèques pour les erreurs, puis calcule les courbes Sholl, le nombre de primaires, afin neurites secondaire et supérieur, et le nombre de points de branchement et des conseils neurites. Enfin, les données sont exportées vers Excel pour l'analyse statistique.
Figure 2: Structure des fichiers nécessaires à l'analyse Bonfire La structure du fichier doit correspondre à cette ou le programme ne fonctionnera pas correctement.. Les noms des dossiers et des fichiers et la quantité des dossiers et les fichiers peuvent être modifiés.
Figure 3: Exemple de sortie de données du programme de Bonfire Un courbes) Sholl Total.. B) Exemple inversé des images de ces deux conditions. C) Nombre moyen de points de branchement et les points terminaux / cellule. D) Nombre moyen de processus / cellule primaire, secondaire et tertiaire ou supérieur neurites. E) Nombre moyen de processus / cellule pour la racine, intermédiaire et neurites terminaux. L'identité spécifique segment F) courbes d'analyse Sholl. Les segments sont regroupées comme primaire, secondaire ou tertiaire ou supérieure. L'identité spécifique segment g) l'analyse des courbes Sholl. Les segments sont regroupés en segments de racines, les segments intermédiaires, ou des segments terminaux.
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Discussion
Le programme de Bonfire est un programme semi-automatisé pour l'analyse de la morphologie des dendrites et des axones. Il augmente considérablement l'efficacité et la précision de l'analyse Sholl plus procéder à l'analyse manuelle. En outre, le programme enregistre les données Bonfire à chaque étape du processus, ce qui permet de vérifier les données et de vérifier l'exactitude de l'analyse. Par conséquent, la tâche de l'analyse des données peuvent être distribuées à de nombreux individus sans compromettre l'exactitude. Enfin, en effectuant l'analyse sur les sous-régions de l'image, le programme est capable d'identifier les changements locaux dans la ramification qui sont manquées lorsque l'analyse Sholl est exécuté uniquement sur l'ensemble de la dendrite ou axone tonnelle. Notre programme est capable d'identifier la manière dont des sous-ensembles spécifiques de neurites sont disposées en référence au corps de la cellule. En conséquence, les schémas de branchement dans les images sont bien représentés par les données qui sont générés par le programme de Bonfire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent pas des intérêts concurrents. Les organismes de financement n'a joué aucun rôle scientifique dans le développement de Bonfire.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de Busch biomédicale, NSF Grant IBN-0548543, NSF Grant IBN-0919747, Mars of Dimes Foundation Grant 1-FY04-107, Mars of Dimes Foundation Grant 1-FY08-464 (pour BLF). MKK et CGL ont été soutenus par les NIH Biotechnologie Formation T32 Grant GM008339-20, et CGL a également été soutenue par une Commission NJ le cordon Spinal Research Fellowship prédoctorale 08-2941-RCS-E-0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
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