Summary
Wir haben ein Computer-Programm, um neuronale Morphologie Analyse entwickelt. In Kombination mit zwei bestehenden Open-Source-Analyse-Tools, führt unser Programm Sholl Analyse und bestimmt die Anzahl der Neuriten, Verzweigungspunkte, und Neuriten Tipps. Die Analysen werden, so dass lokale Änderungen in Neuriten Morphologie beobachtet werden durchgeführt.
Abstract
Neuronale Morphologie spielt eine bedeutende Rolle in der Festlegung, wie Neuronen und Funktion kommunizieren 1-3. Konkret betrifft es die Fähigkeit der Neuronen Signale von vorgeschalteten Zellen erhalten 2 und trägt zur Ausbreitung der Aktionspotentiale 4,5. Die Morphologie der Neuriten beeinflusst auch, wie Informationen verarbeitet werden. Die Vielfalt der Dendriten Morphologien erleichtern lokalen und Long Range Signalisierung und ermöglichen einzelner Neurone oder Gruppen von Neuronen durchzuführen spezialisierte Funktionen innerhalb des neuronalen Netzes 6,7. Änderungen in Dendriten Morphologie, auch die Fragmentierung von Dendriten und Veränderungen in der Verzweigung Muster, haben in einer Reihe von Erkrankungen, darunter Alzheimer 8, Schizophrenie 9,10 und geistige Behinderung 11 beobachtet worden. Die Fähigkeit, beide verstehen die Faktoren, die Dendriten Morphologien zu gestalten und Veränderungen in Dendriten Morphologien zu identifizieren ist wichtig für das Verständnis der Funktion des Nervensystems und Störungen.
Neuriten Morphologie wird oft durch Sholl Analyse und durch Zählen der Anzahl der Neuriten und die Anzahl der Zweigspitzen analysiert. Diese Analyse ist in der Regel um Dendriten angewandt, aber es kann auch Axone angewendet werden. Die Durchführung dieser Analyse von Hand ist sehr zeitaufwändig und führt zwangsläufig zu Variabilität durch Experimentator Bias und Inkonsequenz. Die Bonfire-Programm ist ein semi-automatisches Verfahren zur Analyse von Dendriten und Axonen Morphologie, die auf verfügbare Open-Source-morphologische Analyse-Tools baut. Unser Programm ermöglicht die Erfassung von lokalen Veränderungen in Dendriten und Axonen Verzweigung Verhalten, indem Sholl Analyse auf Teilbereiche des neuritischen Laube. Zum Beispiel ist Sholl Analyse sowohl auf das Neuron als Ganzes als auch auf jeder Teilmenge von Prozessen (Primar-, Sekundar-, Terminal-Wurzel, etc.) Dendrite und Axone Strukturierung ist durch eine Reihe von intra-und extrazellulären Faktoren beeinflusst durchgeführt, viele lokal handeln. Somit ist die resultierende Welle Morphologie aufgrund der spezifischen Prozesse, die auf spezifische Neuriten, die es erforderlich machen morphologische Analyse in einem kleineren Maßstab durchzuführen, um diese lokalen Varianten 12 zu beobachten.
Die Bonfire-Programm erfordert die Verwendung von zwei Open-Source-Analyse-Tools, die NeuronJ Plugin ImageJ und NeuronStudio. Neuronen sind in ImageJ zurückverfolgt und NeuronStudio wird verwendet, um die Konnektivität zwischen Neuriten zu definieren. Bonfire enthält eine Reihe von benutzerdefinierten Skripts in MATLAB (MathWorks) geschrieben, die verwendet werden, um die Daten in das entsprechende Format zu konvertieren für weitere Analysen sind für den Benutzer Fehler zu überprüfen und letztlich durchführen Sholl Analyse. Schließlich werden die Daten in Excel für statistische Auswertungen exportiert werden. Ein Ablaufplan der Bonfire-Programm ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
1. Bevor Sie beginnen:
1) E18 Ratte Dissektion:
Standard-Dissektion Methoden der E18 Hippocampus-Neuronen wurden bisher 13 beschrieben. Um die Bonfire-Programm verwenden, um die morphologischen Merkmale der Neuriten zu analysieren, müssen 8 Bit. Tif Bilder von einzelnen Neuronen gewonnen werden. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten in Abhängigkeit von der experimentellen Protokoll Sie folgende durchgeführt werden. Neuronen können auf einem ausreichend niedrigen Dichte ausplattiert werden, so dass einzelne Nervenzellen im Mikroskop Feld. Alternativ zum Bild einzelner Neuronen, die in einer dichten Kultur gezüchtet werden können Neuronen, transfiziert mit einer Vielzahl von Transfektionsmethoden mit einem Plasmid kodierend für ein fluoreszierendes Protein.
2) Software und Installation:
- Die NeuronJ Plugin für den ImageJ Software von NIH und NeuronStudio müssen beide installiert, um die Bonfire-Programm ausgeführt werden. Die Software-Pakete können auf den folgenden Webseiten gefunden werden:
ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html - Die Bonfire Programm finden Sie unter http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein gefunden werden. Die Bonfire Benutzerhandbuch ist auch auf dieser Website zur Verfügung. Darüber hinaus kann der Erstbeschreibung Bonfire in Langhammer et al, Cytometry 2010 gefunden werden. Alle unsere Daten wurden analysiert mit Hilfe eines Windows-Betriebssystems.
3) Bildauflösung Einstellung:
Sie müssen die Bonfire-Programm auf das Bild Auflösung der Bilder, die Sie analysieren möchten Basis einstellen. In der bonfire_parameters Teil der Bonfire-Programm, ersetzen Sie den aktuellen Wert für die Variable pix_conv mit dem Wert der Bildauflösung (um / Pixel) der Bilder.
2. Dateistruktur:
Damit Bonfire, um Ihre Daten zu analysieren, müssen die Dateien in diesem speziellen Struktur (Abbildung 2) organisiert werden. Sie haben:
- Ein Master-Ordner
- Sub-Ordner (mit allen Ihren anderen Bedingungen)
- Zell-Image-Dateien (filename.tif-Dateien) in den verschiedenen Zustand Ordnern
- A Bonfire Ordner mit den Bonfire Matlab mfiles (auch in der Master-Ordner enthalten)
3. Tracing Neuronen in NeuronJ:
- Bereiten Sie das Bild für die Rückverfolgung
- Öffnen Sie das Bild, indem Sie die Schaltfläche "Öffnen" auf der NeuronJ Symbolleiste und wählen Sie das Bild wie zu verfolgen würden.
- Größe des Bildes, indem Sie den 'zu maximieren "-Taste.
- Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes, so dass Sie alle der Neuriten, indem Sie 'Bild' auf der NeuronJ Symbolleiste wählen Sie dann "Anpassen von Helligkeit / Kontrast" sichtbar machen kann.
- Verfolgen Sie die Zellkörper in NeuronJ und identifizieren die Spur als "Typ 06"
- Wählen Sie den "Add Traces"-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste.
- Trace um den Umfang des Zellkörpers.
- Wählen Sie das 'Label Durchzeichnungen "-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste.
- Wählen Sie 'N1' aus dem 'Tracing ID' Dropdown-Menü.
- Wählen Sie "Typ 06" in der NeuronJ: Attribute und wählen Sie 'OK'.
- Verfolgen Sie die Neuriten in NeuronJ
- Wählen Sie den "Add Traces"-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste.
- Fügen Sie eine Spur entlang jeder Neuriten Branche. Sie können nur die Dendriten oder das Axon, abhängig von Ihrem Experiment.
- Wir schlagen vor, dass die Segmente Sie saugen an jeder Verzweigung zu stoppen, wobei jede Tochter Verzweigungspunkt ab diesem Zeitpunkt als eine neue Spur.
- Wählen Sie den 'Save Durchzeichnungen "-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste.
- Speichern Sie die Rückverfolgung Sie haben gerade in den gleichen Ordner wie die Original-Bilddatei erstellt.
- Exportieren Sie die Trace-Dateien und die Trace-Kennung Datei von NeuronJ
Zwei Arten von Dateien müssen aus NeuronJ exportiert und gespeichert werden in den entsprechenden Zustand Ordner zusammen mit dem. Tif und. NDF-Dateien.- Wählen Sie den "Export Trace"-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste.
- Wählen Sie die "Tab-deliminated Text-Dateien: separate Datei für jede Tracing"-Option auf der "NeuronJ: Export 'Dialog und wählen Sie' OK '.
- Lassen NeuronJ, um die Namen der Dateien und den Speicherort wählen.
- Wählen Sie die "Measure Durchzeichnungen"-Taste auf der NeuronJ Symbolleiste.
- Wählen Sie das 'Display Tracing Messungen' Option in der 'NeuronJ: Messungen "und wählen Sie" Ausführen ".
- Wählen Sie 'Datei' in der 'NeuronJ: Durchzeichnungen "-Fenster.
- Wählen Sie "Speichern unter" und speichern Sie die Datei als Filename_info. "Dateiname" muss exakt mit dem Namen des Original-Bilddatei (einschließlich Groß-/Kleinschreibung) durch _info gefolgt und sollte nicht enthalten: 3-Letter-Datei-Erweiterung. Zum Beispiel für Originalbild Namen Cell20.tif, würde diese Datei mit dem Namen 'Cell20_info "werden. Prüfen Sie, ob Ihr Computer nicht automatisch ein. Xls-Datei-Erweiterung. Ist dies der Fall, muss die Dateiendung manuell gelöscht werden.
4. Verwenden Sie Bonfire vorläufigen SWC-Dateien aus NeuronJ Daten zu erstellen.:
- Reorganisieren Ordner mit "bonfire_load"
- Öffnen Sie Matlab durch einen Doppelklick auf das Symbol.
- Klicken Sie auf die '' Taste in der oberen rechten Ecke des Befehlsfenster.
- Wählen Sie die 'Bonfire' Ordner in Ihrem Master-Ordner in das Fenster "Nach Ordner suchen".
- Type 'bonfire_load' in den Matlab-Befehl-Fenster und drücken Sie Enter.
- Wählen Sie die Bedingung Ordner, den Sie in den "Ordner suchen"-Fenster zu analysieren, und wählen Sie 'OK' wollen.
- Dies wird die Ordner-Struktur durch die Schaffung von Zelle Unterordner mit allen Daten für jede einzelne Zelle neu zu organisieren.
- Erstellen filename_prelim.swc Dateien mit 'bonfire_ndf2swc "
- Type 'bonfire_ndf2swc "in die Kommando-Fenster und drücken Sie Enter.
- Wählen Sie den gleichen Zustand Ordner, den Sie gerade mit 'bonfire_load "in der" Ordner suchen "-Fenster neu, und wählen Sie' OK '.
- Dadurch entsteht ein. SWC-Datei in jede Zelle Ordner für die gewählte Zustand. Jede Zelle Ordner enthält nun 5 Dateien;. Ursprünglichen tif Bild, die NDF-Datei, die _info Schreibspuranzeiger-Datei, eine txt-Datei und eine SWC-Datei....
5. Verwenden Sie NeuronStudio zu Finalize SWC-Dateien.:
- Öffnen und kalibrieren Neuron Bilder in NeuronStudio
- Öffnen Sie die NeuronStudio Programm.
- Wählen Sie Datei → Öffnen der NeuronStudio Symbolleiste.
- Finden Sie die. Tif Bild des Neurons Sie bearbeiten möchten, und öffnen Sie sie.
- Wählen Sie Run → Einstellungen und geben Sie '1 'in jedem der 3 (X, Y, Z)-Boxen in den "Voxel Size"-Fenster.
- Wählen Sie Datei → Import SWC. Wählen Sie die entsprechende. SWC-Datei. Die Image-Datei wird nun mit einer Spur Bild überlagert werden. Die Zelle soma sollte mit einem roten Kreis überlagert werden.
- Verwenden Sie NeuronStudio verlinken Neuriten
- Nutzen Sie die Tools in NeuronStudio korrekt zu identifizieren Zweig-und Endpunkte (wir empfehlen, dass Sie mit NeuronStudio die Funktionen und Verknüpfungen werden vor der Analyse Ihrer Daten bekannt).
- Insbesondere verwenden die "Neuriten Werkzeug", um Knoten, so dass anzuschließen:
- Jeder Zweig Punkt (gelbe Knoten) können nur zwei Zweige
- Alle Spuren sind kontinuierlich mit dem Soma (nur eine rote Knoten)
- Exportieren von Daten aus NeuronStudio
- Wählen Sie Datei → Speichern Neuriten (speichern als die Standard-name).
- Überprüfen Sie auf Fehler in. SWC-Dateien mit 'bonfire_trace_check "
- Type 'bonfire_trace_check' in die Mathlab Befehlsfenster, und drücken Sie die Eingabetaste.
- Wählen Sie die Bedingung Ordner mit den Daten, die Sie gerade in den "Ordner suchen"-Fenster bearbeitet haben, und wählen Sie 'OK'.
- Wenn es irgendwelche Fehler in einem der Bilder im Ordner werden das Programm ausgegebenen Bilder angezeigt werden, wo der Fehler liegt.
- Beheben von Fehlern in NeuronStudio
- Öffnen Sie die Bilddatei, die Sie in den ausführenden Schritt gespeichert.
- Suchen und Beheben des Problems (s).
- Klicken Sie auf Datei → Speichern Neuriten.
- Wiederholen Sie dies für andere Bilder, die behoben werden müssen.
- Rerun "bonfire_trace_check '(5,4).
6. Verwenden Sie 'Freudenfeuer', um morphologische Daten von SWC-Dateien extrahieren.:
- Type 'Bonfire' in das Befehlsfenster, und drücken Sie die Eingabetaste.
- Wählen Sie die Bedingung Ordner, der die gewünschten Daten in die "Ordner suchen"-Fenster zu analysieren, und wählen Sie 'OK' enthält.
- Die Bonfire Analyse erzeugt ein Fenster für jede der Neuronen, die analysiert werden, in denen es Diagramme der neuronalen Morphologie zusammen mit dem Sholl Ringe in der Analyse verwendet. Darüber hinaus wird das "Lagerfeuer"-Befehl generieren. Mat-Datei, die alle morphologischen Informationen, die aus der Analyse entnommen wurde enthält.
7. Verwenden Sie 'bonfire_results', um die Daten anzeigen:
- Type 'bonfire_results' in die Matlab-Befehlsfenster.
- Wählen Sie die Bedingung Ordner für die Bedingung, die Sie gerne in den "Ordner suchen"-Fenster und wählen Sie 'OK' würde.
- Die "Browse for Folder" Fenster vorübergehend zu schließen und wieder öffnen, so dass Sie zusätzliche Bedingungen, die Sie anzeigen möchten wählen.
- Wenn Sie fertig sind wählen Zustand Ordner, wählen Sie 'Abbrechen', um die Auswahl zu beenden.
- "Bonfire_results 'zurückkehren wird Zusammenfassungsdiagramme einschließlich the Daten aus dem Zustand Ordner, die Sie ausgewählt.
8. Verwenden Sie 'bonfire_export' von Daten an Excel Export:
- Type 'bonfire_export "in das Befehlsfenster.
- Wählen Sie die Bedingung Ordner mit den Daten, die Sie gerne in den "Ordner suchen" Fenster exportieren und wählen Sie 'OK' würde. Bonfire_export erstellt Excel-Dateien der morphologischen Daten und wird sie in den Zustand Ordner ausgewählt wurde Platz.
9. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für die Daten von der Bonfire-Programm auf einem Daten-Set mit zwei Bedingungen erzeugt wird, in Abbildung 3 dargestellt. In diesem Beispiel enthalten Bedingung 1 Neuronen mehr Neuriten distal zum Zellkörper. Dieses Phänomen lässt sich am Beispiel Bilder (Abbildung 3B) sowie in der Sholl Kurve der gesamten dendritischen Dorn (Abbildung 3A) und in den Graphen der Anzahl der Klemmstellen (Abbildung 3C) beobachtet werden. Zusätzlich, weil der Bonfire-Programm führt auch Sholl Analyse auf Teilbereiche der Bilder, sind wir in der Lage, genauer zu identifizieren die Identität des Neuriten, die zugenommen haben. Sowohl die Gesamtzahl der Schnittpunkte der 3. Ordnung oder höher Neuriten (Abb. 3F) und die Gesamtzahl der beiden Vermittler und Terminal Neuriten (Abb. 3G) werden erhöht distal zum Zellkörper. Diese Trends können auch in den Abbildungen 3D und 3E beobachtet werden.
Abbildung 1:. Flussdiagramm der Bonfire-Programm Neuronen sind zurück mit ImageJ. Die Daten werden dann exportiert und umgewandelt von der Bonfire-Programm in vorläufig. SWC-Dateien. NeuronStudio wird verwendet, um die Konnektivität des Neuriten zu definieren. Bonfire nach Fehlern sucht und berechnet dann Sholl Kurven, die Anzahl der primären, sekundären und höherer Ordnung Neuriten, und die Zahl der Verzweigungsstellen und Neuriten Tipps. Schließlich werden die Daten nach Excel für statistische Auswertungen exportiert werden.
Abbildung 2: File-Struktur für Bonfire Analyse erforderlich Die Dateistruktur muss mit diesem oder das Programm nicht korrekt ausgeführt werden.. Die Namen der Ordner und Dateien und die Menge der Ordner und Dateien können geändert werden.
Abbildung 3: Beispiel Ausgabe von Daten aus Bonfire Programm A) Total Sholl Kurven.. B) Beispiel Bilder der beiden Bedingungen invertiert. C) Durchschnittliche Anzahl der Verzweigungspunkte und Endpunkten / Zelle. D) Durchschnittliche Anzahl der Prozesse / Zelle für primäre, sekundäre und tertiäre oder größer Neuriten. E) Durchschnittliche Anzahl der Prozesse / Zelle für Root-, Zwischen-und Terminal-Neuriten. F) Segment-spezifische Identität Sholl Analyse Kurven. Die Segmente werden als primäre, sekundäre oder tertiäre oder höher gruppiert. G) Segment-spezifische Identität Sholl Analyse Kurven. Segmente sind als root-Segmente, Zwischen-Segmente oder terminalen Segmente gruppiert.
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Discussion
Die Bonfire-Programm ist ein semi-automatisiertes Programm für die Analyse von Dendriten und Axonen Morphologie. Es erhöht die Effizienz und Genauigkeit der Sholl Analyse über die Durchführung der Analyse manuell. Darüber hinaus spart der Bonfire-Programm die Daten bei jedem Schritt des Prozesses, die es ermöglichen, die Daten zu prüfen und die Genauigkeit der Analyse zu überprüfen. Daher kann die Aufgabe der Datenanalyse an zahlreiche Einzelpersonen ohne Beeinträchtigung der Genauigkeit verteilt werden. Schließlich, indem Sie die Analyse auf Teilbereiche der Bilder, ist das Programm in der Lage, lokale Änderungen in Verzweigungen, die verpasst, wenn Sholl Analyse nur auf die gesamte Dendrit oder Axon Laube betrieben wird, sind zu identifizieren. Unser Programm ist in der Lage zu erkennen, wie bestimmte Teilmengen von Neuriten in Bezug auf den Zellkörper angeordnet sind. Als Ergebnis werden die Verzweigung Muster in den Bildern von den Daten, die von der Bonfire-Programm generiert werden gut vertreten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden Interessen. Die finanzierenden Stellen hatte keine wissenschaftliche Rolle bei der Entwicklung von Bonfire.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Busch Biomedical Grant, NSF gewähren IBN-0548543, NSF gewähren IBN-0919747, March of Dimes Foundation Grant 1-FY04-107, March of Dimes Foundation Grant 1-FY08-464 (zum BLF) unterstützt. MKK und CGL wurden von NIH Biotechnology Training Grant T32 GM008339-20 unterstützt, und CGL wurde auch durch eine NJ Kommission Rückenmarksforschung Promotionsstipendium 08-2941-SCR-E-0 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuronJ plugin | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | ||
| Bonfire program | http://lifesci.rutgers.edu/~firestein | ||
| NeuronStudio | http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html | ||
| MatLab Program | Mathworks |
References
- Elston, G. N. Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with. J Neurosci. 20, (2000).
- Koch, C., Segev, I. The role of single neurons in information processing. Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).
- Poirazi, P., Mel, B. W. Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue. Neuron. 29, 779-796 (2001).
- Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern. J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 290, 739-744 (2000).
- Brette, R. Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies. J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).
- Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation. Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).
- Harrison, P. J. The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain. 122, 593-624 (1999).
- Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons. Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).
- Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules. Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).
- Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).
