Summary
سابونين - permeabilized إعداد الألياف بالتزامن مع تحليل respirometric الفسفرة المؤكسدة يوفر تقييم تكاملية وظيفة الميتوكوندريا. يمكن تنفس الميتوكوندريا في الدول الفيزيولوجية المرضية وتعكس التأثيرات التنظيمية المختلفة بما في ذلك التفاعلات الميتوكوندريا ، مورفولوجيا والكيمياء الحيوية.
Abstract
التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا يمثل معيارا هاما للفسيولوجيا القلب كما تشارك في استقلاب الميتوكوندريا والطاقة ، والاكسدة ، موت الخلايا المبرمج ، والشيخوخة ، encephalomyopathies الميتوكوندريا وسمية المخدرات. ونظرا لهذا ، والتقنيات لقياس وظيفة القلب الميتوكوندريا هي في الطلب. أسلوب واحد أن يعمل هذا النهج التكاملي لقياس وظيفة الميتوكوندريا هي respirometric الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) التحليل.
يتمحور مبدأ تقييم OXPHOS respirometric حول قياس تركيز الأوكسجين الاستفادة من وجود القطب كلارك. كما يستهلك حزمة الألياف permeabilized تركيز الأكسجين الأكسجين ، وانخفاض في غرفة مغلقة. المعايرة باستخدام بروتوكولات مختارة الركيزة - مانع uncoupler ، يتم توفير الإلكترونات إلى مواقع محددة من سلسلة نقل الإلكترون ، مما يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا. وتستخدم تقنيات لتحليل التحضيرية التي تسبق respirometric وظيفة الميتوكوندريا والميكانيكية والكيميائية لpermeabilize في غمد الليف العضلي من ألياف العضلات. permeabilization الكيميائية تستخدم لثقب انتقائي سابونين غشاء الخلية مع الحفاظ على الهيكل الخلوي.
هذه الورقة توضح بدقة الخطوات المتبعة في إعداد سابونين البشرة ألياف القلب لقياس استهلاك الأوكسجين لتقييم OXPHOS الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، حل المشاكل ، وكذلك تقديم المشورة ركائز محددة ، ويتم توفير مثبطات uncouplers التي يمكن استخدامها لتحديد وظيفة الميتوكوندريا في مواقع محددة من سلسلة نقل الإلكترون. الأهم من ذلك ، قد يكون وصف بروتوكول تطبيقها بسهولة على أنسجة القلب والهيكل العظمي من مختلف النماذج الحيوانية وعينات الإنسان.
Protocol
1. تحضير كاشف
- مستعدة الحل الاسترخاء والمحافظة (RP الحل) كما هو موضح سابقا مع تعديلات طفيفة 1. باختصار ، الحل RP يتكون من EGTA 2.77mM 2 CaK ، 7.23mM K EGTA 2 ، إيميدازول 20mM ، dithiothreitol 0.5mM ، توراين 20mM ، 50mM K - MES ، 6.56 MgCl 2 ، 5.7mM ATP ، فسفوكرياتين 14.3mM ، ودرجة الحموضة 7.1 ، تعديل في درجة حرارة الغرفة (RT). مرشح الحل من خلال مرشح 0.45 ميكرون ، لتعقيم. تقسيمها إلى أجزاء 15 مل (فالكون أنابيب البولي بروبلين) وتخزينها في -20 درجة مئوية انظر المناقشة عن وصفات.
- يتم تحضير محلول قياس التنفس الميتوكوندريا (MiR05) كما هو موضح سابقا (2) ويحتوي على 0.5mM EGTA ، MgCl 3mM 0.6 2 H 2 O ، توراين 20mM ، 10MM KH 2 PO 4 ، HEPES 20mM ، BSA 1G / L ، 60mM البوتاسيوم lactobionate ، 110mM السكروز ، ودرجة الحموضة 7.1 ، عدلت في 30 درجة مئوية. مرشح الحل من خلال مرشح 0.45 ميكرون ، لتعقيم. تقسيمها إلى أجزاء 50 مل (فالكون أنابيب البولي بروبلين) وتخزينها في -20 درجة مئوية. انظر المناقشة عن وصفات. عامل الذوبان في الأكسجين لMiR05 عند 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية 0.92 3.
2. تحضير الأنسجة
ألف القلب الألياف إعداد الميكانيكية
- تمت الموافقة على الإجراءات المتبعة في جامعة كالغاري رعاية الحيوان واستخدام اللجنة والالتزام من قبل الجمعية الكندية لوضع مبادئ توجيهية لمختبر علوم الحيوان التجريب.
- خلع عنق الرحم لشل حركة الماوس هو الأسلوب المفضل. بدلا من ذلك ، أن تدار intraperotineal (IP) وحقن كيتامين زيلازين (80 و 10mg/kg ، على التوالي) من الصوديوم أو 0.5mg/kg بنتوباربيتال. ملاحظة : الصوديوم بنتوباربيتال هو المانع من عكسها NADH نازعة (I المعقدة) 4.
- إزالة القلب ووضعه في طبق بتري ، التي تحتوي على حل RP على الجليد (الشكل 1A). إزالة بعناية أي النسيج الضام و / أو الدهون باستخدام مجهر تشريح.
- قطع القلب في نصف طول الحاجز. المكوس 10 - 25mg الوزن الرطب (ww) من الأنسجة عن طريق قطع من سطح البطانة من البطين الأيسر (1B الشكل). ضمان شق على طول اتجاه الألياف لتقليل الأضرار الميكانيكية لعضلة القلب.
- ضع تشريح ، عينة فرعية من الأنسجة في طبق بتري منفصلة تحتوي على حل RP على الجليد. باستخدام مجهر تشريح القلب قطع طولية إلى شرائح على طول اتجاه الألياف مع قطره 1.5mm - 1.
- تقصير شرائط مع مشرط لأطوال 4mm - 2 (الشكل 1C).
- استخدام الحذر الشديد والحاد ملقط حزم الألياف ميكانيكيا منفصلة. وينبغي أن تحتوي على حزم من الألياف النهائي بحد أقصى من 6-8 الألياف ، ومناطق صغيرة متصلة بواسطة الاتصال ، وزنها لا يزيد عن وزن رطب 5mg. وينصح من ألياف القلب 1 - 3mg رطب. بصريا ، ويجب أن تتغير من أنسجة القلب الأصلي لتلوين أحمر وردي شاحب (1D الشكل).
باء القلب إعداد حزم الالياف الكيماوية
- وضع لوحة 12 - جيدا على الجليد.
- شطف جيدا (s) مع الحل RP الكالسيوم للحد من التلوث 5.
- نقل حزم الألياف ميكانيكيا أعدت لتحتوي كذلك 3mL حل RP الجليد الباردة مع 50ug / مل سابونين. ملاحظة : إن تركيز سابونين لا تعتمد على كمية الحاضر عضلة القلب في الحل.
- لاحتضان 20min خفيفة مع التحريك على الجليد.
جيم حزمة الألياف القلبية الغسل
- شطف بئر جديدة مع MiR05 الكالسيوم للحد من التلوث 5.
- نقل حزم القلب إلى 10ML جديدة تحتوي أيضا الجليد الباردة MiR05. لاحتضان 10min خفيفة مع التحريك على الجليد.
- كرر (1-2) 2-3 مرات مع MiR05 الطازجة. الخطوات هي الغسيل المتكرر للتأكد من إزالة أو سابونين ، ATP ، ADP وركائز أي المتبقية من حزم من الألياف.
دال تحديد الوزن الرطب
- قبل مباشرة لتحليل الجهاز التنفسي ، ويتم الحصول على الوزن الرطب بواسطة النشاف حزم الألياف الفردية (1 - 3mg رطب) على سطح ماص (ورق فلتر) باستخدام ملقط وعقد الألياف إلى السطح ل5S أو حتى كل الرطوبة شرير بعيدا.
- باستخدام سطح آخر ماصة ، وإزالة السائل الزائد من ملقط.
- الفارغة حجم ووضع حزمة من الألياف البلاستيكية على وزن القارب لقياس الكتلة.
- نقل حزمة الألياف القلبية إلى بئر جديدة مع الثلج الباردة MiR05. حزمة الألياف مستعد لتقييم استهلاك الأوكسجين.
3. Respirometric OXPHOS التحليل
ألف معدات Respirometric
- ويستخدم المختبر وتوصي اثنين غرفة المعايرة حقن oxygraph (Oroboros Oxygraph2 - K ، Oroboros الآلات). وOxygraph 2 ك عروض عالية قياس التنفس القرار في جزء كبير منه من خلال استخدام الأجهزة والبرمجيات مفيدة (DatLab) الذي يقلل من دور فعال الخلفية التي تساهم فيالتحف استهلاك الأوكسجين.
- معايرة oxygraph هو خطوة ضرورية للحد من آثار الخلط بين استهلاك الأوكسجين مفيدة. المعايرة يختلف قليلا على oxygraph. الرجوع إلى دليل المستخدم oxygraph لإجراءات محددة.
باء الممثل بروتوكول التحقق من جودة التحكم / تقنيات
- ضمان تمت إضافة MiR05 في السكن غرف oxygraph أجهزة الاستشعار الاوكسجين تخطيط الاستقطاب (POS) وإعطاء الوقت الكافي لتشبع الهواء ، وموازنة للMiR05 عند 37 درجة مئوية قبل وضع الفئران ألياف القلب في غرف oxygraph.
- يتم وضع عينات من الألياف القلب في MiR05 أثار الغرف oxygraph. ملاحظة : تأكد من الحانات واثارة PVDF أو نظرة خاطفة المغلفة قضبان النمام (قطره 6mm).
- باستخدام حقنة مليئة الأكسجين ، وزيادة تركيز الأوكسجين من غرف oxygraph ل550uM - 250. تجدر الإشارة إلى أن تركيز الأوكسجين هو تحد للتحضير الألياف permeabilized على 50 ٪ حتى تشبع الهواء أعلاه 6. 5 - 10min تسمح للاستقرار تركيز الأوكسجين.
- باستخدام microsyringe 25μL هاملتون ، إضافة 10μL من الغلوتامات 2M و5μL من مالات 800mM للحصول على التركيز النهائي لل10MM و2mm و، على التوالي. هذه المعايرة تسمح لتحديد معقدة القاعدية أنا المدعومة التنفس (2 الدولة ، وغياب ADP). وينبغي أن تدفق الأوكسجين الاستقرار داخل 5min ما يقرب من المعايرة. وينبغي توفير الاعداد المناسب جدا استنساخه استهلاك الأوكسجين الدولة 2.
- التالية 5min - 2 من استهلاك الأوكسجين مستقرة ، إضافة 20μL من ADP 500mM لتركيز النهائي من 5mM (تشبع) ، وذلك باستخدام microsyringe 25μL هاملتون ، للتنفس (الدولة 3) الميتوكوندريا القصوى من خلال دراسات معقدة أولا قلة استخدام هذا عالية من تركيز من ADP ، ومع ذلك ، فمن المهم الإشارة إلى أن يتم التوصل إلى تشبع فقط أكبر من 90 ٪ في تركيزات أعلى من 7 5mM.
- التالية 5min - 2 من استهلاك الأوكسجين مستقرة ، إضافة 5μL من ج السيتوكروم 4mM للحصول على التركيز النهائي لل10μM ، وذلك باستخدام microsyringe 10μL هاملتون ، لتحليل ومراقبة الجودة للغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) النزاهة.
- التالية 5min - 2 من استهلاك الأوكسجين مستقرة ، إضافة 1μL من 4mg / oligomycin مل ، وذلك باستخدام microsyringe 10μL هاملتون ، لتثبيط سينسيز اعبي التنس المحترفين. وسوف توفر هذه الخطوة المعايرة التحقق من الغشاء الداخلي intactness الميتوكوندريا.
- بعد تقييم OXPHOS respirometric. يتم الاحتفاظ العينة عن الوزن الجاف أو الميتوكوندريا تحديد علامة.
- إزالة MiR05 من الغرف الزجاجية لoxygraph. غسل غرف لا يقل عن ثلاث مرات بالماء المقطر (DDH 2 O).
- غسل غرف على الأقل ثلاث مرات مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ (EtOH) لإزالة EtOH للذوبان مثل مثبطات oligomycin.
- غسل الغرف بنسبة 70 ٪ ثلاث مرات EtOH مع EtOH النهائية 70 ٪ غسل 30min دائم لتعقيم غرف oxygraph.
- قبل إضافة بروتوكول جديد للMiR05 المعايرة التجريبية ضمان غسل الغرف التي تحتوي على نقاط البيع خمس مرات على الأقل مع DDH 2 O.
- ويمكن إجراء المعايرة والتحقق من صحة بروتوكول الفردية (الشكل 2) أو المعايرة ويمكن أن تدرج في بروتوكول المعايرة مدروسة تبعا لأهداف تجريبية والتشخيص للدراسات قياس التنفس.
4. ممثل النتائج :
يتم تقييم استهلاك الأوكسجين في اعداده على نحو صحيح ألياف القلب الفئران من خلال نوعية بروتوكول التحكم كما هو مبين في الشكل 2. الأرقام 3-5 أمثلة التي تعترض عادة من ألياف القلب أعدت بشكل غير صحيح. نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) تمثل مؤشرا هاما في قياس التنفس. هذه المعلمة يشير إلى اقتران بين استهلاك الأوكسجين والفسفرة المؤكسدة. في الأعمال التحضيرية الألياف permeabilized وRCR هو معدل التنفس النسبي في ولاية إلى 3 أو 2 أو 3 على الدولة بدلا من الدولة 4 (الناجمة عن oligomycin و / أو atractyloside ، ATR). وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام RCR بوصفها علامة الجودة لضمان ويمكن التعرف على التغيرات في اقتران الناجمة عن التدخلات التجريبية أو مرضية 5. جيدا إلى جانب الاستعدادات permeabilized القلب الفئران تسفر عن RCR بين 3-6 اعتمادا على حل الحضانة تستخدم 1 و 8 و 9.
يتم استخدام المعايرة من السيتوكروم ج ك التحقق من إعداد الأنسجة السليمة. ج السيتوكروم هو بروتين الموجود في الفضاء intermembrane في غشاء الميتوكوندريا الداخلية 10. عندما الغشاء الخارجي للالميتوكوندريا غير سليمة ، والذاتية السيتوكروم ج يبقى في الفضاء intermembrane والمعايرة للخارجية السيتوكروم ج له تأثير يذكر على التنفس (الشكل 2). في حالة تلف الغشاء الخارجي للالميتوكوندريا ، يمكن أن يتم الافراج عن الذاتية السيتوكروم ج من الفضاء ، وسوف تمنع intermembrane تنفس حتى السيتوكروم الخارجيةج بالإضافة إلى ذلك (الشكل 3). ينبغي أن يتم التحضير المناسب تجربة فقط ارتفاع طفيف في تدفق الأكسجين التالية بالإضافة ج السيتوكروم في نطاق 5-15 ٪ 5. بالإضافة إلى ذلك ، وهذا يسمح المعايرة تجريبية لتقييم تأثير الضغوطات المرضية أو التجريبية على الميتوكوندريا intactness الغشاء الخارجي. إذا كان من ذوي الخبرة تأثير ج السيتوكروم ، وضمان الرعاية أثناء إعداد الميكانيكية و / أو تقليل تركيز نسيج سابونين.
بالإضافة إلى ذلك يتم استخدام و / أو oligomycin ATR لتقييم التغيرات في التنفس تسرب ؛ استهلاك الأوكسجين لا تساهم في الفسفرة ADP 11. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم استخدام هذه الخطوة بمثابة معايرة التحقق من إعداد نموذج مناسب. وينبغي أن تحكم أو البرية من نوع الألياف تكون حساسة لهذا الجمع وتشهد انخفاضا كبيرا في تدفق الأوكسجين. A RCR منخفضة وحساسية لخفض و / أو oligomycin ATR مما أدى إلى تدفق الأوكسجين مرتفعة نسبيا يشير إلى الأضرار التي لحقت غشاء الميتوكوندريا الداخلية أثناء إعداد (الشكل 4). هو على الأرجح مدى الضرر الناجم خلال الفصل الميكانيكي للألياف القلب مثل الغشاء الداخلي الميتوكوندريا هي أقل عرضة للاهانة من قبل سابونين النسبي لغشاء الميتوكوندريا الخارجي. ومع ذلك ، قد إعداد على حد سواء الميكانيكية والكيميائية يجب أن تكون تبعا لذلك لتجنب ألياف القلب أعدت بشكل غير صحيح 5 و 12.
ينبغي للحزم الألياف سابونين البشرة من الفئران لا تبقى في حل من البرنامج العادي للحصول على مزيد من 6H أو الحل MiR05 لأكثر من 2H. قد عدم استجابة إلى الركيزة ، مثبط - uncoupler المعايرة كما رأينا في الشكل رقم 5 يكون مؤشرا على فترات حضانة طويلة. وينبغي بذل جهود لاحقة تقليل الفترات بين التضحية الحيوانية وقياسات استهلاك الأوكسجين.
الشكل 1. اعداد الفئران الميكانيكية للحزم ألياف القلب. A. تشريح القلب بأكمله التالي على الفور. باء عينة 10 - 25mg من البطين الأيسر الأمامي. جيم أنسجة القلب فصل في القطر 1MM وشرائح بطول 2 - 4mm. دال النهائي حزم ألياف القلب مستعد لpermeabilization الكيميائية مع سابونين.
الشكل 2. نتائج الممثل إعداد الأنسجة السليمة الاستفادة من تقييم تخطيط الاستقطاب. ويدعم تدفق الأوكسجين 2 بواسطة الدولة المعقدة الغلوتامات ركائز الأول ومالات (M / G) ويتم تحفيز كبير بعد إضافة ADP (الدولة 3). أي تأثير تنشيطية للخارجية بالإضافة ج السيتوكروم يدل على الغشاء الخارجي الميتوكوندريا سليمة. حساسية استهلاك الاوكسجين الى oligomycin يوحي سلامة غشاء الميتوكوندريا الداخلية سليمة. يتم تحديد تركيز الاوكسجين في غرفة مغلقة 2 مل من الخط الأزرق. ويمثل استهلاك الأوكسجين من عينة أنسجة القلب في غرفة مغلقة 2 مل من خط أحمر. مالات والغلوتامات ، M / G ، ثنائي فسفات الأدينوساين ، ADP ؛ السيتوكروم ج ، ج خلوي ؛ Oligomycin ، O.
الشكل 3. تأثير ج السيتوكروم اختبار التحقق من صحة استخدام التقييم تخطيط الاستقطاب. ويدعم تدفق الأوكسجين 2 بواسطة الدولة المعقدة الغلوتامات ركائز الأول ومالات (M / G) ويتم تحفيز كبير بعد إضافة ADP (الدولة 3). بالإضافة إلى ذلك من تأثير تنشيطية خارجية ج السيتوكروم يشير ذلك إلى المساس الخارجي سلامة غشاء الميتوكوندريا. يتم تحديد تركيز الاوكسجين في غرفة مغلقة 2 مل من الخط الأزرق. ويمثل استهلاك الأوكسجين من عينة أنسجة القلب في غرفة مغلقة 2 مل من خط أحمر. مالات والغلوتامات ، M / G ، ثنائي فسفات الأدينوساين ، ADP ؛ السيتوكروم ج ، ج خلوي
الشكل 4. سلامة غشاء الميتوكوندريا الداخلية اختبار التحقق من صحة استخدام التقييم تخطيط الاستقطاب. ويدعم تدفق الأوكسجين 2 بواسطة الدولة المعقدة الغلوتامات ركائز الأول ومالات (M / G) والتحفيز ضعيفة نسبيا من استهلاك الأوكسجين بعد إضافة ADP (الدولة 3). حساسية من الفقراء إلى استهلاك الأوكسجين oligomycin يوحي تلف الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. يتم تحديد تركيز الاوكسجين في غرفة مغلقة 2 مل من الخط الأزرق. ويمثل استهلاك الأوكسجين من عينة أنسجة القلب في غرفة مغلقة 2 مل من خط أحمر. مالات والغلوتامات ، M / G ، ثنائي فسفات الأدينوساين ، ADP Oligomycin ، O.
الشكل 5. التقييم تخطيط الاستقطاب التالية حضانة طويلة في MiR05. استهلاك الأوكسجين غير حساس لإضافة الخارجية من الغلوتامات ومالات (M / G) واستهلاك الأوكسجين بعد إضافة ADP (يتم تخفيض حالة 3). هو من ذوي الخبرة ليس هناك أي تأثير تنشيطية للخارجية بالإضافة ج السيتوكروم وعدم الحساسية لاستهلاك الأوكسجين إلى oligomycin. عدم الرد على الإضافات إلى حل حضانة extramitochondrial يوحي للخطر الاستقرار الوظيفي الميتوكوندريا. يتم تحديد تركيز الاوكسجين في غرفة مغلقة 2 مل من الخط الأزرق. ويمثل استهلاك الأوكسجين من عينة أنسجة القلب في غرفة مغلقة 2 مل من خط أحمر. مالات والغلوتامات ، M / G ، ثنائي فسفات الأدينوساين ، ADP ؛ السيتوكروم ج ، ج خلوي
1. ملاحظات : إعداد الكاشف
إعداد الحل K EGTA 2 ألبوم 100mM
| اسم كاشف | التركيز النهائي (مم) | g/100 مل H 2 O |
| جلايكول الإثيلين ، مكررا (2 - aminoethylether) -- N ، N ، N '، N' - tetraacetic حمض (EGTA) | 100 | 3،805 |
| هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | 200 | 1.15 |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 في درجة حرارة الغرفة.
إعداد الحل كا 2 EGTA ألبوم 100mM
| اسم كاشف | التركيز النهائي (مم) | g/100 مل H 2 O | تعليقات (اختياري) |
| جلايكول الإثيلين ، مكررا (2 - aminoethylether) -- N ، N ، N '، N' - tetraacetic حمض (EGTA) | 100 | 3،805 | الحرارة إلى 80 درجة مئوية ، وأقل ما يقال اثارة. |
| كربونات الكالسيوم (كربونات الكالسيوم 3) | 100 | 1،001 | يجب أن يكون دقيقا تركيز الكالسيوم والكالسيوم ينظم وظيفة العضيات المختلفة بما في ذلك الميتوكوندريا. solubilization ضمان كامل لجميع كربونات الكالسيوم 3. يجب على الحل النهائي أن تكون شفافة تماما. في البداية يتم خلط كربونات الكالسيوم 3 مع بعض EGTA والماء لتنشيط تكوين حمض الكربونيك وثاني التبخر 2. ويمكن تسريع هذا التفاعل عن طريق تسخين تصل إلى 80 درجة مئوية. |
| هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | 200 | 1.15 | تحييد مع KOH بعد اكتمال التبخر من ثاني أكسيد الكربون 2. |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 في درجة حرارة الغرفة.
إعداد الاسترخاء والحفاظ على الحل (RP الحل) 1
| الكاشف | التركيز النهائي (مم) | للتر الواحد | تعليقات |
| K 2 EGTA | 7.23 | 72.3 مل | |
| 2 CaK EGTA | 2.77 | 27.7 مل | |
| إيميدازول | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0.5 | ||
| توراين | 20 | 2.52g | |
| ملح الصوديوم الأدينوزين ثلاثي الفوسفات 5' - هيدرات (ATP) | 5.7 | 3.14g | |
| فسفوكرياتين (PCR) | 14.3 | 4.0g | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) | 6.56 | 0.624g | |
| K - MES | 50 | 14.0g |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 في درجة حرارة الغرفة
إعداد الحل قياس التنفس الميتوكوندريا (MiR05 الحل) 2
| الكاشف | التركيز النهائي (مم) | للتر الواحد | تعليقات (اختياري) |
| جلايكول الإثيلين ، مكررا (2 - aminoethylether) -- N ، N ، N '، N' - tetraacetic حمض (EGTA) | 0.5 | 0.190g | استخدامها بوصفها خالب من الكالسيوم |
| كلوريد المغنيسيوم hexahydrate (0.6 MgCl 2 H 2 O) | 3.0 | 0.610g | لا يمكن إعداد نوعية الألياف يتم اختبارها بدون المغنيسيوم 2 +. |
| توراين | 20.0 | 2.502g | توراين هو عامل استقرار الغشاء والمضادة للأكسدة. 20mM هو تركيز الخلايا الموجودة في القلب. |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH 2 ص 4) | 10.0 | 1.361g | |
| 20.0 | 4.77g | ||
| البوتاسيوم lactobionate | 60.0 | 120 مل من 0.5 M K - lactobionate الأوراق المالية | K - 0.5M lactobionate ألبوم : إضافة حمض ز 35.83 lactobionic إلى 100 مل O 2 H والرقم الهيدروجيني إلى 7.0 في RT. ضبط مستوى الصوت الى 200 مل مع DDH 2 O. تستخدم لتكرار عالية + K الخلايا التركيز. في السابق كان يستخدم بوكل ، ومع ذلك ، فإن ارتفاع الكلورين ، يمنع وظيفة الميتوكوندريا كيناز الكرياتين. |
| السكروز | 110.0 | 37.65g | استخدامها بوصفها زبال ريوس. |
| الأبقار مصل الزلال (BSA) | 1G / L | 1G | كما تستخدم غشاء استقرار ، المضادة للأكسدة ، وخالب من الكالسيوم والأحماض الدهنية الحرة. |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 عند 30 درجة مئوية
3. ملاحظات : Respirometric OXPHOS التحليل
باء حدد ركائز ، ومثبطات uncouplers
قائمة مختارة من ركائز لتحليل قياس التنفس الميتوكوندريا
| الركيزة | [ألبوم] | إعداد | حجم بنسبة 2 مل | [النهائي] | تعليقات |
| الأدينوساين الملح monopotassium 5' - ثنائي فسفات ثنائي الهيدروكسيل (ADP) | 500mM | 246mg / مل DDH 2 O. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 في RT. المحل في -80 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 20ul | 5mM | المستمر للحفاظ على المغنيسيوم 2 + + خلال تجارب قياس التنفس إضافة 0.6 مول MgCl 2 / ADP مول. |
| أسكوربات | 800mM | 0.1584g / مل DDH 2 O. المحل في -20 درجة مئوية في 200 aliquots ميكرولتر. ضوء حساسية | 5 ميكرولتر | 2mm و | بمثابة الركيزة عند استخدامها بالتوازي مع TMPD. يجب أن الصحيح لتدفق الأكسجين لأكسدة التلقائي. |
| السيتوكروم C | 4mM | 50mg / مل DDH 2 O. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 5 ميكرولتر | 10uM | |
| السيانيد الكربونيل ف (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP) | 0.1mM | 0.254mg/10 مل EtOH 100 ٪. تخزينها في قارورة زجاجية في -20 درجة مئوية في 500 aliquots ميكرولتر. | الخطوات من 1 ميكرولتر | بمثابة uncoupler. يحدد أقصى طاقة النقل الإلكترون وجود أي قيود على نقل الإلكترون من قبل النظام الفسفرة. | |
| الغلوتامات | 2M | 0.3742g / مل DDH 2 O. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 في RT. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 10ul | 10MM | بمثابة الركيزة لNADH نازعة (مجمع الأول). |
| مالات | 800mM | 0.1073g / مل DDH 2 O. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 في RT. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 5ul | 2mm و | بمثابة الركيزة لNADH نازعة (مجمع الأول). لا يمكن دعم التنفس وحده. |
| البيروفات | 1M | 11mg/0.1 مل DDH 2 O. إعداد جديدة. | 5 ميكرولتر | 2.5mM | بمثابة الركيزة لNADH نازعة (مجمع الأول). |
| سكسينات | 1000mM | 1.3505g / 5 مل DDH 2 O. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 في RT. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 20ul | 10MM | بمثابة الركيزة لنازعة سكسينات (II المعقدة). |
| ن ، ن ، ن '، N' - رباعي ميثيل - pphenylenediamine هيدروكلوريد (TMPD) | 200MM | 47.1mg / مل DDH 2 O. إضافة إلى تركيز 0.8M أسكوربات النهائي 10MM لمنع السيارات للأكسدة في مخزن -20 درجة مئوية في 200 aliquots ميكرولتر. | 5 ميكرولتر | 0.5mM | تأكسد تلقائي من الحل واضح من جانب الأسهم مظهر التلوين باللون الأزرق. بمثابة الركيزة عند استخدامها بالتوازي مع TMPD. يجب أن الصحيح لتدفق الأكسجين لأكسدة التلقائي. |
قائمة مثبطات مختارة لتحليل قياس التنفس الميتوكوندريا
| الركيزة | [ألبوم] | إعداد | حجم كل غرفة 2 مل | [النهائي] | تعليقات |
| Antimycin A | 5mM | 27.4mg/10 مل EtOH 100 ٪. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 1 ميكرولتر | 2.5μM | مثبط لأنزيم س : ج السيتوكروم oxidoreductase (مجمع الثالث) </ TD> |
| Atractyloside | 50mM | 40mg / مل DDH 2 O. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. | 30 ميكرولتر | 0.75mM | المانع من سينسيز اعبي التنس المحترفين. |
| Oligomycin | 4mg / مل | 4mg / مل EtOH 100 ٪. المحل في -20 درجة مئوية في 200 aliquots ميكرولتر. | 1 ميكرولتر | المانع من سينسيز اعبي التنس المحترفين. | |
| سيانيد البوتاسيوم | 1M | 65.1mg / مل DDH 2 O. إعداد جديدة. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 في RT | 1 ميكرولتر | 1MM | المانع من السيتوكروم أوكسيديز ج (IV المعقدة). الاستفادة TMPD التالية والمعايرة أسكوربات الوصول إلى تأكسد تلقائي. |
| روتينون | 0.1mM | 0.39mg/10 مل EtOH 100 ٪. المحل في -20 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر. ضوء الحساسة. | 1 ميكرولتر | 0.05μM | المانع من NADH نازعة (I المعقدة). قد يكون مطلوبا تركيزات أعلى ، ولكن ، للحد من احتباس روتينون في الغرفة تبدأ على النحو المبين. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وسابونين - permeabilized تقنية الألياف القلبية يقدم حلا وسطا بين فريد في المختبر والمجراة في تقييم الميتوكوندريا من استهلاك الأوكسجين OXPHOS. تشمل زيادة مزايا هذه التقنية أهمية فسيولوجية مقارنة الميتوكوندريا المعزولة والعمارة الخليوي هي الحفاظ عليها. في حين أن غشاء البلازما هي المتدهورة ، وهياكل غشاء الخلايا الميتوكوندريا بما في ذلك 12 و 14 و 14 شبكية الهيولى العضلية ، والهيكل الخلوي myofilaments 1 و 17 لا تزال سليمة. وعلاوة على ذلك ، فإن التفاعلات بين الهيكل الخلوي والميتوكوندريا 1 ، 17 وأيضا دون تغيير. الميتوكوندريا في الألياف permeabilized تظهر زيادة الاستقرار. ويمكن تخزين الاستعدادات الألياف القوارض في حلول المحميات الجليد الباردة لعينات من الألياف 6H والبشرية تظهر الاستقرار لمدة تصل إلى 18،2 24H. الميتوكوندريا موازنة تجربة سريعة مع الحل الحضانة. وهذا يسمح السيطرة المباشرة على تحليل موقع محدد في سلسلة نقل الإلكترون ردا على ركائز المضافة ، ومثبطات uncouplers 1 و 5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا الأسلوب في الموقع لا يتطلب سوى بضعة ملليغرامات من الأنسجة.
لا يمكن أن القيود المفروضة على تقنية الألياف سابونين البشرة لا يمكن تجاهلها. الميتوكوندريا القلب غير متجانسة ، تتكون من اثنين من المجموعات السكانية الفرعية ؛ subsarcolemmal واللييفات وفي قياس التنفس الميتوكوندريا الموقع يقيم مجموع السكان الميتوكوندريا من دون القدرة على التمييز بين المجموعات السكانية الفرعية 5. بالإضافة إلى ذلك ، الأيض الخلوي والعوامل المختلفة عصاري خلوي تنظيم وظيفة الميتوكوندريا. يتم فقدان هذه المكونات عصاري خلوي من الألياف القلبية أثناء عملية permeabilization مما أدى إلى عدم القدرة على تقييم الميتوكوندريا في الدقيقة الحية في البيئة 5.
قضايا الإبلاغ هي أهم ما يشغل. ويمكن التعبير عن القياسات استهلاك الأوكسجين في الوزن الرطب أو الوزن الجاف ، ولكن كثافة الميتوكوندريا هو عامل رئيسي في عدم التجانس تدفق الجهاز التنفسي عندما أعرب في كتلة النسيج 7. من المهم أن نفهم أن تفسير معدلات التنفس والتغيرات تتأثر بشكل كبير عن طريق اختيار دولة المرجعية. للمقارنات مباشرة لنتائج OXPHOS respirometric في الألياف permeabilized ، يجب أن يتم التعبير عن المعدلات النسبية للعلامة مرجعية مشتركة مثل الحمض النووي ، سترات النشاط سينسيز ، السيتوكروم أوكسيديز ج النشاط ، و / أو محتوى السيتوكروم AA3 19.
باختصار ، إعداد permeabilized الألياف المستخدمة في تحليل بالتزامن مع قياس التنفس يسمح لتقييم وظيفة تكاملية من الميتوكوندريا القلب. وقد استخدمت الدول المرضية المختلفة ونماذج هذه التقنية الجينية. وتشمل هذه تقييم سمية المخدرات التي يسببها ، والشيخوخة والسكري وقصور القلب الاحتقاني ، والإصابة الدماغية والاكسدة في علم وظائف الأعضاء الميتوكوندريا 5 و 20. وقد تم استعراض العديد من منهجية ممتازة والمخطوطات من تقنية الألياف سابونين - permeabilized تخطيط الاستقطاب وتقييم استهلاك الأوكسجين تنطبق 1 ، 5 ، 14 ، 20 ويوصى بشدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة وكندا الجينوم. JS يحمل جوائز دعم راتب من مؤسسة التراث ألبرتا للأبحاث الطبية ، والقلب والسكتة الدماغية مؤسسة كندا وجمعية السكري الكندية. والمختبر أن نعترف المساعدة التقنية من آلات Oroboros خلال الاستحواذ على تقنية الألياف سابونين - permeabilized.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
