Summary
Saponin-проницаемыми волокна подготовки в сочетании с respirometric окислительного фосфорилирования обеспечивает анализ интегративной оценки митохондриальной функции. Митохондриальная дыхания в физиологических и патологических состояний могут отражать различные регуляторных влияний в том числе митохондриальных взаимодействий, морфологии и биохимии.
Abstract
Исследование функции митохондрий, представляет собой важный параметр сердечной физиологии митохондрий принимают участие в энергетическом обмене, окислительный стресс, апоптоз, старение, митохондриальная encephalomyopathies и токсичности препаратов. Учитывая это, технологий для измерения сердечной функции митохондрий, пользуются спросом. Один из методов, который использует комплексный подход для оценки митохондриальной функции respirometric окислительного фосфорилирования (OXPHOS) анализа.
Принцип оценки respirometric OXPHOS сосредоточена вокруг измерения концентрации кислорода использованием электрода Кларка. Как проницаемыми расслоение потребляет кислород, концентрация кислорода в закрытой камере снижается. Использование выбранный субстрат-ингибитор-разобщающий агент протоколов титрования, электроны предоставляются участки, специально предназначенные электрон-транспортной цепи, позволяющие оценки митохондриальной функции. До respirometric анализ митохондриальной функции, механические и химические методы подготовительных используются для permeabilize сарколеммы мышечных волокон. Химическая пермеабилизации работают сапонин выборочно перфорировать мембраны клетки, сохраняя при этом сотовая архитектура.
Эта статья полностью описывает шаги, связанные с подготовкой сапонин кожей сердечных волокон для измерения потребления кислорода для оценки митохондриальной OXPHOS. Кроме того, устранение неполадок консультации, а также специфических субстратов, ингибиторов и разобщители, которые могут быть использованы для определения функции митохондрий в определенных участков электрон-транспортной цепи предоставляются. Важно отметить, что описанный протокол может быть легко применить к сердечной и скелетной ткани различных моделей животных и человека образцов.
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Релаксации и сохранение решение (RP решения) получают, как описано выше, с незначительными изменениями 1. Короче говоря, решение RP состоит из 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 мМ имидазол, 0,5 мм дитиотреитол, 20мм таурин, 50 мМ К-MES, 6,56 MgCl 2, 5.7 мм АТФ, фосфокреатина 14.3mM, рН 7,1, с поправкой при комнатной температуре (RT). Фильтр решение через 0,45-мкм фильтр для стерилизации. Разделите на 15 мл порциями (Falcon полипропиленовые трубы) и хранят при температуре -20 ° C См. обсуждение по рецептам.
- Митохондриальная Решение Respirometry (MiR05) получают, как описано выше 2 и содержит 0,5 EGTA, 3 мМ MgCl 2 6H 2 O, 20 мм таурин, 10 мМ KH 2 PO 4, 20 мМ HEPES, 1 г / л BSA, калий-60 мм лактобионата, 110мм сахароза, рН 7,1, с поправкой на 30 ° C. Фильтр решение через 0,45-мкм фильтр для стерилизации. Разделите на 50 мл порциями (Falcon полипропиленовые трубы) и хранят при температуре -20 ° C. См. обсуждение по рецептам. Коэффициент растворимости кислорода для MiR05 при 30 ° С и 37 ° С составляет 0,92 3.
2. Подготовка ткани
А. Сердечные волокна механической подготовки
- Процедуры были одобрены Университета Калгари уходу и использованию животных комитета и соблюдать Канадской ассоциации лабораторных животных науки руководящие принципы для экспериментов.
- Шейки дислокации для иммобилизации мыши является предпочтительным методом. Кроме того, intraperotineal (IP), инъекции кетамина и ксилазина (80 и 10mg/kg, соответственно) или 0.5mg/kg натрия пентобарбитал могут быть введены. Примечание: натрия фенобарбитала является обратимый ингибитор NADH дегидрогеназы (комплекс I) 4.
- Удалить сердце и поместить его в Петри-блюдо с решением RP на льду (рис. 1А). Осторожно удалите соединительную ткань и / или жира использованием рассечение микроскопом.
- Вырезать сердце пополам вдоль перегородки. Акцизный 10-25 мг сырого веса (сырого веса) ткани, за счет сокращения с поверхности эндокарда левого желудочка (рис. 1В). Обеспечить разрез вдоль ориентации волокон, чтобы минимизировать механическое повреждение миокарда.
- Место рассеченные, подвыборке ткани в отдельных Петри-блюдо с решением RP на льду. Использование микроскопа рассечение вырезать сердце на продольные полосы вдоль ориентации волокон с диаметром 1-1.5м.
- Сокращение полосы с скальпель длиной 2-4мм (рис. 1в).
- Использование крайне осторожно и острыми щипцами механически отдельные пачки волокна. Заключительные расслоений должна содержать максимум 6-8 волокон, соединенных небольших участках соприкосновения, весом не более 5 мг сырого веса. Сердечные волокна 1-3 мг сырого веса рекомендуются. Визуально, сердечной ткани должно измениться с оригинальной красной до бледно-розовой окраски (рис. 1D).
Б. Сердечная расслоения химической подготовки
- Место 12-луночного планшета на льду.
- Промыть хорошо (ы) с RP решение свести к минимуму загрязнение кальция 5.
- Передача механически подготовлены расслоений к хорошо содержащей 3 мл ледяной RP решение с 50ug / мл сапонин. Примечание: концентрация сапонина не зависит от количества сердечной мышцы в настоящем решении.
- Инкубировать 20 минут с легкой помешивая на льду.
С. Сердечная расслоение Стиральная
- Промыть новая скважина с MiR05 чтобы свести к минимуму загрязнение кальция 5.
- Передача сердечной связки, чтобы новая скважина содержащих 10 мл ледяной MiR05. Инкубируйте в течение 10 минут с легкой помешивая на льду.
- Повтор (1-2) 2-3 раза со свежими MiR05. Повторяющихся шагов мытья обеспечить устранение или сапонины, АТФ, АДФ и все оставшиеся подложки из расслоения.
Д. Влажные определения веса
- Непосредственно перед дыхательных анализа, сырая масса получается промокательной отдельных расслоения (1-3 мг сырого веса) на абсорбирующие поверхности (фильтровальная бумага) с помощью пинцета и проведение волокна на поверхность в течение 5 секунд или пока вся влага есть зло прочь.
- Использование другого поглощающая поверхность, удалить лишнюю жидкость из щипцов.
- Тара масштаб и место расслоение на пластиковой лодке весят для измерения массы.
- Передача сердечной расслоение на новый колодец с ледяной MiR05. Расслоения готов к кислороду оценки потребления.
3. Respirometric Анализ OXPHOS
А. Respirometric оборудование
- Лаборатория использует и рекомендует две камеры титрования впрыском oxygraph (Oroboros Oxygraph2-к, Oroboros Instruments). Oxygraph 2-K обеспечивает высокое разрешение respirometry в значительной степени за счет использования инструментальных аппаратного и программного обеспечения (DatLab), что сводит к минимуму инструментальным оформлением, которые способствуютартефакты потребления кислорода.
- Калибровка oxygraph является важным шагом, чтобы минимизировать последствия смешанные инструментальные потребления кислорода. Калибровка немного варьируется в зависимости от oxygraph. Обратитесь к oxygraph руководство пользователя для конкретных процедур.
Б. представитель Контроль качества / Техника Проверка протокола
- Обеспечить MiR05 была добавлена на жилье oxygraph камер полярографического датчиков кислорода (POS) и отводить достаточно времени для насыщения воздуха и уравновешивания MiR05 при 37 ° С до ввода мышиной сердечных волокон в камерах oxygraph.
- Сердечных образцов волокна расположены в перемешивают MiR05 палат oxygraph. Примечание: Убедитесь, перемешать баров PVDF-или PEEK покрытием баров мешалки (6 мм в диаметре).
- Использование кислорода заполненный шприц, повышение концентрации кислорода в камерах oxygraph к 250-550uM. Следует отметить, что концентрация кислорода является предельным для проницаемыми волокна препаратов при даже 50% выше насыщения воздуха 6. Разрешить 5-10мин для кислорода стабилизации концентрации.
- Использование 25 мкл микрошприца Гамильтон, добавить 10 мкл 2М глутамата и 5 мкл до 800 мм малат для получения конечной концентрации 10 мМ и 2 мм соответственно. Эти титрования позволяет для определения фундамента я поддержке дыхания (состояние 2, отсутствие ADP). Кислород потока должна стабилизироваться в течение примерно 5 минут титрования. Правильная подготовка должна обеспечить высокую воспроизводимость состояния 2 потребления кислорода.
- После 2-5мин стабильного потребления кислорода, добавить 20 мкл 500 мм ADP для конечной концентрации 5 мМ (насыщения), используя 25 мкл микрошприца Гамильтон, для максимального (состояние 3) митохондриального дыхания через сложные I. Лишь в немногих исследованиях использования этого максимума концентрации АДФ, тем не менее, важно отметить, что более 90% насыщение достигается только при концентрации выше 5 мМ 7.
- После 2-5мин стабильного потребления кислорода, добавить 5 мкл 4 мм цитохрома С для получения конечной концентрации 10 мкм, используя 10 мкл микрошприца Гамильтон, для контроля качества анализа внешней мембране митохондрий (ОММ) целостности.
- После 2-5мин стабильного потребления кислорода, добавить 1 мкл из 4 мг / мл олигомицину, используя 10 мкл микрошприца Гамильтон, для подавления АТФ-синтазы. Этот шаг титрования будет предлагать проверки внутреннего митохондрий сохранность мембраны.
- После respirometric оценки OXPHOS. Образец сохраняется для сухой вес или митохондриальной определения маркера.
- Удалить MiR05 из стекла палат oxygraph. Вымойте камеры по крайней мере три раза дистиллированной водой (DDH 2 O).
- Вымойте камеры по крайней мере в три раза со 100% этанола (этанол), чтобы удалить EtOH растворимые ингибиторы, такие как олигомицину.
- Вымойте камеры с 70% этанола в три раза с конечной 70% этанола мыть прочного 30 минут для стерилизации oxygraph камер.
- Перед добавлением MiR05 для нового экспериментального протокола титрования обеспечить камерах, содержащих POS моются по крайней мере пять раз с DDH 2 O.
- Проверка титрования может осуществляться как отдельным протоколом (рис. 2) или титрования могут быть включены в хорошо спланированной титрования протокол в зависимости от экспериментальных и диагностических целей respirometry исследований.
4. Представитель Результаты:
Потребление кислорода в должным образом подготовлены мышиной сердечные волокна оценивается протокол контроля качества, как показано на рисунке 2. Цифры 3-5 обеспечивают наиболее часто встречающихся примеров неверно оформленных сердечных волокон. Дыхательный коэффициент (РКП), представляет собой важный показатель в respirometry. Этот параметр указывает связь между потреблением кислорода и окислительного фосфорилирования. В проницаемыми подготовки волокна, RCR-скорость дыхания в состоянии 3 по отношению к состоянию 2 или же состояние 3 над государственными 4 (индуцированной олигомицином и / или atractyloside, ATR). Кроме того, RCR может быть использован как маркер контроля качества и может определить изменения в связи в результате экспериментальной или патологических вмешательств 5. Ну связью проницаемыми мышиной сердечной подготовка выход RCR между 3-6 в зависимости от инкубационный раствор использовали 1, 8, 9.
Титрования цитохрома С используется в качестве проверки надлежащей подготовки ткани. Цитохром с является белок находится в межмембранного пространства на внутренней мембраны митохондрий 10. При наружной мембраны митохондрий, не повреждена, эндогенного цитохрома С остается в межмембранном пространстве и титрования экзогенного цитохрома С имеет незначительное влияние на дыхание (рис. 2). Если наружной мембраны митохондрий поврежден, эндогенный цитохром с может быть освобожден от межмембранном пространстве и подавляют дыхание, пока экзогенного цитохромас того (рис. 3). Правильная подготовка должна испытывать лишь незначительное повышение в потоке кислорода следующие цитохром с добавлением в 5-15% диапазоне 5. Кроме того, это экспериментальное титрования позволяет оценить влияние патологического или экспериментальные стрессора на внешней митохондриальной сохранность мембраны. Если эффект цитохрома с опытными, обеспечить уход во время механической подготовки ткани и / или уменьшения концентрации сапонина.
Кроме того олигомицина и / или ATR используется для оценки изменений в утечке дыхания, потребление кислорода не способствовали ADP фосфорилирования 11. Кроме того, этот шаг титрования могут быть использованы в качестве проверки надлежащей подготовки образца. Управления или дикого типа волокна должны быть чувствительны к этому сложение и опыт значительное снижение кислорода потока. Низкий RCR и пониженной чувствительностью к олигомицину и / или ATR в результате относительно повышенных потоке кислорода указывает на повреждение на внутренней мембране митохондрий в процессе подготовки (рис. 4). Ущерб, скорее всего, индуцированных в процессе механического разделения сердечных волокон в качестве внутренней мембране митохондрий менее чувствительны к оскорбление сапонин по отношению к внешней мембране митохондрий. Однако, как механические, так и химической подготовки, возможно, придется скорректировать, чтобы избежать неправильно подготовленные сердечные волокна 5, 12.
Сапонин кожей расслоения от мышей не должны оставаться в решении RP более 6 часов или MiR05 решение в течение более чем 2 часа. Отсутствие ответа на субстрат-ингибитор-разобщающий агент титрования, как показано на рисунке 5 может указывать на длительный инкубационный период. Последующие усилия должны минимизировать периоды между жертву животных и измерения потребления кислорода.
Рисунок 1. Механическая подготовка мышиной сердечной расслоений. А. всем сердцем сразу после вскрытия. B. 10-25 мг образца передних левого желудочка. С сердечной ткани разделены на диаметр 1 мм и 2-4мм полосы длиной. D. Заключительные сердечной расслоений готов к химической пермеабилизации с сапонин.
Рисунок 2. Представителю результаты надлежащей подготовки ткани использованием полярографического оценки. Состояние 2 потоке кислорода поддерживается комплексом Я субстратов глутамат и малат (M / G) и значительно стимулировала после добавления АДФ (состояние 3). Нет стимулирующее действие экзогенных того цитохрома С указывает внешней мембране митохондрий не повреждена. Чувствительность потребления кислорода к олигомицину предполагает внутреннюю целостность митохондриальных мембран не повреждена. Концентрация кислорода в камере 2 мл закрыты определяется по синей линии. Потребление кислорода сердечной образец ткани в 2-х камерного мл закрыты представлена красной линией. Малат и глутамат, M / G; аденозиндифосфата, АДФ, цитохром с, Цито с; Олигомицин, o.
Рисунок 3. Цитохром с эффектом проверки тест использованием полярографического оценки. Состояние 2 потоке кислорода поддерживается комплексом Я субстратов глутамат и малат (M / G) и значительно стимулировала после добавления АДФ (состояние 3). Стимулирующий эффект экзогенного цитохрома с того указывает внешней митохондриальной мембраны целостность находится под угрозой. Концентрация кислорода в камере 2 мл закрыты определяется по синей линии. Потребление кислорода сердечной образец ткани в 2-х камерного мл закрыты представлена красной линией. Малат и глутамат, M / G; аденозиндифосфата, АДФ, цитохром с, Цито c.
Рисунок 4. Внутренние мембраны митохондрий целостности проверки тест использованием полярографического оценки. Состояние 2 потоке кислорода поддерживается комплексом Я субстратов глутамат и малат (M / G) и относительно слабой стимуляции потребления кислорода после добавления АДФ (состояние 3). Бедные чувствительность потребления кислорода к олигомицину предполагает внутреннюю мембрану митохондрий поврежден. Концентрация кислорода в камере 2 мл закрыты определяется по синей линии. Потребление кислорода сердечной образец ткани в 2-х камерного мл закрыты представлена красной линией. Малат и глутамат, M / G; аденозиндифосфата, ADP Олигомицин, o.
Рисунок 5. Полярографические оценки после продолжительной инкубации в MiR05. Потребление кислорода не чувствителен к экзогенным добавлением глутамата и малата (M / G) и потребления кислорода после добавления АДФ (состояние 3) снижается. Существует не стимулирующее действие экзогенного цитохрома С того и нечувствительность потребления кислорода к олигомицину переживается. Отсутствие ответа на дополнений в решение extramitochondrial инкубации предлагает митохондриальной функциональную стабильность находится под угрозой. Концентрация кислорода в камере 2 мл закрыты определяется по синей линии. Потребление кислорода сердечной образец ткани в 2-х камерного мл закрыты представлена красной линией. Малат и глутамат, M / G; аденозиндифосфата, АДФ, цитохром с, Цито c.
1. Примечания: Подготовка реагентов
Подготовка К 2 EGTA 100mM маточного раствора
| Название реагента | Конечная концентрация (мкМ) | г/100 мл H 2 O |
| Этиленгликоль-бис-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetic кислоты (EGTA) | 100 | 3,805 |
| Гидроксид калия (КОН) | 200 | 1,15 |
Примечание: Регулировка рН до 7,4 при комнатной температуре.
Подготовка Са 2 EGTA 100mM маточного раствора
| Название реагента | Конечная концентрация (мкМ) | г/100 мл H 2 O | Комментарии (необязательно) |
| Этиленгликоль-бис-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetic кислоты (EGTA) | 100 | 3,805 | Нагреть до 80 ° С и перемешать мягко. |
| Карбонат кальция (CaCO 3) | 100 | 1,001 | Концентрация кальция должна быть точной, как кальций регулирует функции различных органелл, в том числе митохондрии. Обеспечить полное растворение всех CaCO 3. Окончательное решение должно быть полностью прозрачным. CaCO 3 изначально смешивается с EGTA и немного воды, чтобы активировать образование угольной кислоты и CO 2 испарения. Эта реакция может быть ускорен путем нагревания до 80 ° C. |
| Гидроксид калия (КОН) | 200 | 1,15 | Нейтрализовать с КОН после испарения СО 2 будет завершена. |
Примечание: Регулировка рН до 7,4 при комнатной температуре.
Подготовка Релаксация и сохранение Solution (Решение RP) 1
| Реагент | Конечная концентрация (мкМ) | За литр | Комментарии |
| К 2 EGTA | 7,23 | 72,3 мл | |
| CAK 2 EGTA | 2,77 | 27,7 мл | |
| Имидазол | 20 | 1.36g | |
| Дитиотреитол | 0,5 | ||
| Таурин | 20 | 2.52g | |
| Аденозин-5'-трифосфата динатриевая соль гидрата (АТФ) | 5,7 | 3.14g | |
| Фосфокреатина (ПЦР) | 14,3 | 4,0 г | |
| Хлорид магния (MgCl 2) | 6,56 | 0.624g | |
| К-МЧС | 50 | 14.0g |
Примечание: Регулировка рН до 7,1 при комнатной температуре
Подготовка Митохондриальная Решение Respirometry (MiR05 решение) 2
| Реагент | Конечная концентрация (мкМ) | За литр | Комментарии (необязательно) |
| Этиленгликоль-бис-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetic кислоты (EGTA) | 0,5 | 0.190g | Используется в качестве хелатор кальция |
| Хлорид магния гексагидрат (MgCl 2 6H 2 O) | 3,0 | 0.610g | Качества волокна препарат не могут быть протестированы без Mg 2 +. |
| Таурин | 20,0 | 2.502g | Таурин стабилизатор мембраны и антиоксидант. 20 мМ является внутриклеточной концентрации присутствует в сердце. |
| Фосфат калия однозамещенный (KH 2 PO 4) | 10,0 | 1.361g | |
| 20,0 | 4.77g | ||
| Калий-лактобионата | 60,0 | 120 мл 0,5 М K-лактобионата акции | 0,5 М К-лактобионата складе: Добавить 35,83 г lactobionic кислотой до 100 мл Н 2 О и рН до 7,0 при комнатной температуре. Регулировка громкости до 200 мл с DDH 2 O. Используется для репликации высокие внутриклеточные концентрации K +. Ранее KCl был использован, однако, высокая Cl-угнетает функции митохондрий креатинкиназы. |
| Сахароза | 110,0 | 37.65g | Используется в качестве мусорщика АФК. |
| Бычьего сывороточного альбумина (БСА) | 1 г / л | 1g | Используется как стабилизатор мембраны, антиоксидантным, и хелат кальция и свободных жирных кислот. |
Примечание: Регулировка рН до 7,1 при 30 ° С
3. Примечания: Respirometric Анализ OXPHOS
B. Выберите субстратов, разобщители и ингибиторы
Список выбранных Подложки для анализа митохондриальной Respirometry
| Подложка | [Состав] | Подготовка | Объем, приходящийся на 2 мл | [Матч] | Комментарии |
| Аденозин-5'-дифосфат monopotassium соли дигидрат (ADP) | 500 мм | 246mg / мл DDH 2 O. Отрегулируйте рН до 7,1 при комнатной температуре. Хранить при температуре -80 ° C в 250 мкл аликвоты. | 20 мкл | 5 мМ | Для поддержания постоянной Mg 2 + + во время экспериментов respirometry добавить 0,6 моль MgCl 2 / моль ADP. |
| Аскорбат | 800 мм | 0.1584g / мл DDH 2 O. Хранить при температуре от -20 ° C в 200 мкл аликвоты. Светочувствительный | 5 мкл | 2 мМ | Выступает в качестве подложки при использовании параллельно с ТМФД. Необходимо исправить для кислорода поток для авто-окисления. |
| Цитохром С | 4мм | 50 мг / мл DDH 2 O. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. | 5 мкл | 10uM | |
| Карбонильные цианида р-(трифторметокси) phenylhydrazone (FCCP) | 0,1 мм | 0.254mg/10 мл 100% этанола. Хранить в стеклянных флаконах при температуре -20 ° С в 500 мкл аликвоты. | Шаги 1 мкл | Действует как разобщающий агент. Определяет максимальный объем электронного транспорта и какого-либо ограничения электронного транспорта путем фосфорилирования системы. | |
| Глутамат | 2M | 0.3742g / мл DDH 2 O. Отрегулируйте рН до 7,1 при комнатной температуре. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. | 10ul | 10 мМ | Выступает в качестве субстрата для NADH дегидрогеназы (комплекс I). |
| Малат | 800 мм | 0.1073g / мл DDH 2 O. Отрегулируйте рН до 7,1 при комнатной температуре. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. | 5ul | 2 мМ | Выступает в качестве субстрата для NADH дегидрогеназы (комплекс I). Не поддерживает дыхания в покое. |
| Пируват | 1М | 11mg/0.1 мл DDH 2 O. Подготовка свежей. | 5 мкл | 2,5 мм | Выступает в качестве субстрата для NADH дегидрогеназы (комплекс I). |
| Сукцинат | 1000мм | 1.3505g / 5 мл DDH 2 O. Отрегулируйте рН до 7,1 при комнатной температуре. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. | 20 мкл | 10 мМ | Выступает в качестве субстрата для сукцинатдегидрогеназы (комплекс II). |
| N, N, N ', N'-тетраметил- pphenylenediamine Дигидрохлорид (TMPD) | 200 мМ | 47.1mg / мл DDH 2 O. Добавить 0.8M аскорбиновой кислоты до конечной концентрации 10 мМ, чтобы предотвратить автоматическое окисления Хранить при температуре от -20 ° C в 200 мкл аликвоты. | 5 мкл | 0,5 мм | Автоокисления маточного раствора очевидным появление синей окраски. Выступает в качестве подложки при использовании параллельно с ТМФД. Необходимо исправить для кислорода поток для авто-окисления. |
Список выбранных ингибиторов для анализа митохондриальной Respirometry
| Подложка | [Состав] | Подготовка | Тома на 2 палаты мл | [Матч] | Комментарии |
| Антимицином | 5 мМ | 27.4mg/10 мл 100% этанола. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. | 1 мкл | 2,5 мкм | Ингибитор коэнзим Q: цитохром с оксидоредуктазы (комплекс III) </ TD> |
| Atractyloside | 50 мМ | 40 мг / мл DDH 2 O. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. | 30 мкл | 0,75 мм | Ингибитор синтазы АТФ. |
| Олигомицин | 4 мг / мл | 4 мг / мл 100% этанола. Хранить при температуре от -20 ° C в 200 мкл аликвоты. | 1 мкл | Ингибитор синтазы АТФ. | |
| Цианистый калий | 1М | 65.1mg / мл DDH 2 O. Подготовка свежей. Отрегулируйте рН до 7,1 при комнатной температуре | 1 мкл | 1mM | Ингибитор оксидазы цитохрома с (комплекс IV). Используйте следующие ТМФД и Аскорбат титрования для доступа автоокисления. |
| Ротенон | 0,1 мм | 0.39mg/10 мл 100% этанола. Хранить при температуре от -20 ° C в 250 мкл аликвоты. Свет чувствительны. | 1 мкл | 0.05μM | Ингибитор дегидрогеназу NADH (комплекс I). Более высокие концентрации могут потребоваться, однако, для уменьшения ротенон удержания в камере начинают, как описано. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сапонин-проницаемыми сердечной техника волокна предлагает уникальный компромисс между в пробирке и в естественных оценки митохондриальной потребления кислорода OXPHOS. Преимущества этого метода включают повышенную физиологическую значимость по сравнению с изолированными митохондриями, как сотовые архитектуры сохраняется. В то время как плазматическая мембрана разрушается, внутриклеточных мембранных структур митохондрий в том числе 12, 14, саркоплазматического ретикулума 14, myofilaments и цитоскелета 1, 17 остаются без изменений. Более того, взаимодействие между митохондриями и 1 цитоскелета, 17, также без изменений. Митохондрии в проницаемыми волокна показывают повышенную устойчивость. Подготовка грызунов волокна могут быть сохранены в ледяной консервации решений для 6ч и человеческих образцов волокна проявляют устойчивость на срок до 24 часа 18,2. Митохондрии опыт быстрого уравновешивания с инкубационный раствор. Это позволяет прямой контроль над конкретным участкам анализ электрон-транспортной цепи в ответ на добавленную субстратов, ингибиторов и разобщители 1, 5. Кроме того, это на месте техника требует только несколько миллиграммов ткани.
Ограничения сапонин кожей волокна техника не может быть проигнорировано. Сердечная митохондрий неоднородны, состоящий из двух субпопуляций;. Subsarcolemmal и interfibrillar В месте митохондриальной respirometry оценивает общую митохондриальной населения без способности различать субпопуляций 5. Кроме того, в различных клеточных метаболитов и цитозольного факторы регулируют функции митохондрий. Эти компоненты цитозольного сердечного волокна потеряны во время пермеабилизации процесс, приводящий к невозможности оценки митохондриальной в точном в естественных условиях окружающей среды 5.
Вопросы, связанные с являются важной проблемой. Измерения потребления кислорода может быть выражено в сырой массы или сухого веса, однако, митохондриальной плотности является основным фактором в дыхательных неоднородность потока, когда в расчете на тканевой массы 7. Важно понимать, что интерпретация частота дыхания и изменения Большое влияние на выбор ведения государства. Для прямого сравнения результатов respirometric OXPHOS в проницаемыми волокон, ставки должны быть выражены по отношению к общим маркером ссылки, такие как митохондриальная ДНК, активность цитрат-синтазы, цитохром с оксидазы деятельности, и / или содержание цитохрома Aa3 19.
Таким образом, проницаемыми волокна препарата в сочетании с respirometry анализ позволяет оценить интегративной функции сердечных митохондрий. Различные патологические состояния и генетической модели использовали эту технику. К ним относятся оценка медикаментозного токсичности, старение, диабет, застойная сердечная недостаточность, ишемическая повреждения и окислительного стресса на митохондриальной физиологии 5, 20. Несколько превосходных методологических обзоров и рукописей сапонин-проницаемыми техника волокна и полярографического оценки потребления кислорода были ранее опубликованы 1, 5, 14, 20 и мы настоятельно рекомендуем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения и Геном Канада. JS имеет зарплату поддержки награды от Альберта Heritage Foundation медицинских исследований сердца и инсульта фонда Канады и Канадской Ассоциации Диабета. Лаборатория хотел бы выразить признательность технической помощи инструментов Oroboros при приобретении сапонин-проницаемыми волокна техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
