Summary
respirometric 산화 인산화 분석과 함께 사포닌 - permeabilized 섬유 준비 mitochondrial 기능의 통합 평가를 제공합니다. 생리학 및 병리 학적 상태에서 Mitochondrial 호흡은 mitochondrial 상호 작용, 형태학 및 생화학 등 다양한 규제의 영향을 반영하실 수 있습니다.
Abstract
mitochondria가 에너지 대사, 산화 스트레스, apoptosis, 노화, mitochondrial encephalomyopathies 및 약물 독성에 관련된으로 mitochondrial 기능의 조사는 심장 생리학의 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 이것을 감안할 때, 심장 mitochondrial 기능을 측정하는 기술 수요에 있습니다. mitochondrial 기능을 측정하는 통합 접근 방식을 채택 한 기술은 respirometric 산화 인산화 (OXPHOS) 분석입니다.
respirometric OXPHOS 평가의 원칙은 클락 전극을 이용하여 산소 농도를 측정 중심이다. permeabilized 섬유 번들 폐쇄 챔버 감소에 산소, 산소 농도를 소모로. 선택된 기판 - 억제 - uncoupler 적정 프로토콜을 사용하여, 전자는 mitochondrial 기능의 평가를 허용, 전자 수송 사슬의 특정 사이트에 제공됩니다. , mitochondrial 함수의 respirometric 분석하기 전에 기계적 및 화학적 준비 기술은 근육 섬유의 sarcolemma을 permeabilize로 활용하고 있습니다. 화학 permeabilization는 세포 구조를 유지하면서 선택적으로 세포막을 구멍에 사포닌 고용합니다.
본 논문은 철저히 mitochondrial OXPHOS을 평가하기 위해 산소 소비 측정에 대한 사포닌 피부 심장 섬유 준비에 관련된 단계를 설명합니다. 또한, 조언뿐만 아니라 특정 기판 문제 해결, 전자 수송 사슬의 특정 사이트에서 mitochondria 기능을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 저해제와 uncouplers이 제공됩니다. 중요한 것은 설명 프로토콜은 쉽게 다양한 동물 모델과 인간의 샘플의 심장과 골격 조직에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 시약 준비
- 이전에 사소한 수정 1 설명된대로 휴식과 보존 용액 (RP 솔루션)이 준비됩니다. 간단히, RP 솔루션 조정 2.77mM CaK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20mM 이미다졸, 0.5mM dithiothreitol, 20mM 타우린, 50mM K - MES, 6.56 MgCl 2, 5.7mM ATP, 14.3mM phosphocreatine, 산도 7.1로 구성되어 있습니다 실온 (RT)에서. 소독에 0.45 - μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. -20 15 ML 부분 (팰컨 폴리 프로필렌 튜브)와 저장소로 나누어 ° C 조리법에 대한 논의를 참조하십시오.
- Mitochondrial Respirometry 솔루션 (MiR05)는 이전에 2 설명된대로 준비 및 60mM 칼륨 - lactobionate, 110mM 0.5mM EGTA, 3mM MgCl 2 0.6 H 2 O, 20mM 타우린, 10mM KH 2 PO 4, 20mM HEPES, 1g / L BSA를 포함합니다 30 조정 자당, 산도 7.1 ° C. 소독에 0.45 - μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. -20 ° C. 50 ML 부분 (팰컨 폴리 프로필렌 튜브)와 저장소로 나눌 조리법에 대한 논의를 참조하십시오. 30 MiR05에 대한 산소 용해도 계수는 ° C 37 ° C가 0.92 3.
2. 조직 준비
A. 심장은 섬유 기계 준비
- 절차는 캘거리 애니멀 케어 대학 승인 및위원회를 사용하여 실험을위한 실험실 동물 과학 지침 캐나다 협회가 준수했다.
- 마우스를 고정하기 위해 자궁 경부 전위가 선호하는 방법입니다. 또는 intraperotineal (IP) 마취제와 xylazine의 사출 (각각 80 및 10mg/kg) 또는 pentobarbital 나트륨의 0.5mg/kg이 실시됩니다. 참고 : pentobarbital 나트륨은 NADH 탈수소 효소 (복잡한 I) 4 가역 억제제이다.
- 마음을 제거하고 얼음 (그림 1A)에서 RP 솔루션을 포함하는 배양 - 접시에 놓으십시오. 조심스럽게 해부 현미경을 사용하는 결합 조직 및 / 또는 지방을 제거합니다.
- 심장 따라 반으로 마음을 잘라요. 좌심실의 endocardium 표면 (그림 1B)에서 절단하여 조직의 소비세는 10 - 25mg 서부 유럽 표준시 중량 (WW). 확인 절개는 myocardium에 기계적 손상을 최소화하기 위해 섬유 방향을 따라합니다.
- 얼음 RP 솔루션을 포함하는 배양 - 접시 별도의 조직의 해부, subsample를 놓습니다. 해부 현미경을 사용하면 1 - 1.5mm의 직경 섬유 방향을 따라 세로 스트립에 심장을 잘라.
- 2~4mm (그림 1C)의 길이에 메스로 스트립을 단축.
- 극단적인 관심과 날카로운 집게 기계 별도의 광섬유 번들을 사용합니다. 최종 섬유 번들 5mg WW보다 더 이상 무게도 연락 작은 영역으로 연결되어 6-8 섬유의 최대, 포함해야합니다. 1 - 3mg WW의 심장 섬유 것이 좋습니다. 시각, 심장 조직이 연한 분홍색 착색 (그림 1D)에 원래의 빨간색에서 변경해야합니다.
B. 심장 섬유 번들 화학 준비
- 얼음에 12 잘 플레이트를 놓습니다.
- 칼슘 오염 5 최소화하기 위해 RP 솔루션으로 잘 (들)을 씻어.
- 50ug / ML 사포닌과 잘 들어있는 3mL 얼음처럼 차가운 RP 솔루션에 기계적으로 준비 섬유 번들을 전송합니다. 참고 : 사포닌의 농도가 솔루션에 심장 근육 현재의 양에 의존하지 않습니다.
- 얼음 가벼운 교반과 함께 20 분에 대해 품어.
C. 심장 섬유 번들 워싱
- 칼슘 오염 5 최소화하기 위해 MiR05으로 새 우물을 씻어.
- 얼음처럼 차가운 뉴 웰 포함된 10mL MiR05에 심장병 번들을 전송합니다. 얼음 가벼운 교반과 함께 10 분에 대해 품어.
- 신선한 MiR05와 반복 (1-2) 2-3 번. 반복 세척 단계를 제거하거나 사포닌, ATP, ADP와 섬유 번들에서 남아있는 기판을 보장하는 것입니다.
D. 습식 중량 결정
- 호흡 분석에 직접 전에, 젖은 무게 집게를 사용하여 흡수성 표면 (여과지)에 개별 섬유 묶음 (1 - 3mg WW)를 모래 바닥과 기들을위한 표면에 섬유를 개최하거나 모든 습기가 멀리 사악한까지 얻을 수 있습니다.
- 다른 흡착제 표면에 사용하여, 포셉에서 초과 액체를 제거합니다.
- 테어 규모와 플라스틱에 섬유 번들 장소 대량 측정 보트를 달다.
- 얼음처럼 차가운 MiR05과 뉴 웰에 심장 섬유 번들을 전송합니다. 섬유 번들 산소 소비량 평가 준비가되었습니다.
3. Respirometric OXPHOS 분석
A. Respirometric 장비
- 실험은 두 개의 챔버 적정 - 분사 oxygraph을 이용하여하는 것이 좋습니다 (Oroboros Oxygraph2 - K, Oroboros 악기). Oxygraph 2 - K는에 기여하는 계기 배경을 최소화 수단 하드웨어 및 소프트웨어 (DatLab)를 이용하여 많은 부분에서 고해상도 respirometry를 제공합니다산소 소비 유물.
- oxygraph의 교정 수단 산소 소비의 혼란함을 주죠 영향을 최소화하기 위해 필수적인 단계입니다. 보정은 약간 oxygraph에 따라 다릅니다. 특정 절차에 대한 oxygraph 사용자 설명서를 참조하십시오.
B. 대표 품질 관리 / 기술 검증 프로토콜
- MiR05이 polarographic 산소 센서 (POS)과 37 MiR05의 공기 채도와 평균에 대한 충분한 시간을주지는 ° C 이전 oxygraph 챔버스에 murine 심장병 섬유를 이야기를하려고 oxygraph 챔버스 주택에 추가되었습니다 확인합니다.
- 심장 섬유 샘플은 oxygraph 챔버스의 흔들 MiR05에 배치됩니다. 참고 : 저어 바가 확인 PVDF 또는 피크 - 코팅 활동가 바 (6mm 직경).
- 산소 채워진 주사기를 사용하여, 250 - 550uM에 oxygraph의 실의 산소 농도를 높일 수 있습니다. 이것은 산소 농도가 공기 포화 6 이상도 50 % permeabilized 섬유 준비에 대한 제한입니다 언급해야합니다. 산소 농도 안정화를위한 5 10 분 소요됩니다.
- 25μL 해밀턴 microsyringe 사용하여 각각 10mM과 2mM의 최종 농도를 구하는 800mM malate의 2M 글루 탐 산염과 5μL의 10μL를 추가합니다. 이러한 titrations은 기초 복잡한 I - 지원 호흡 (; ADP의 부재 주 2)의 결정에 대한 수 있습니다. 산소 유량은 적정 약 5 분 이내에 안정화해야합니다. 적절한 준비는 매우 재현성 상태이 산소 소비를 제공해야합니다.
- 안정적인 산소 소비량의 2 5 분 후, 복잡한 I. 거의 연구가 집중이 높은 사용을 통해 최대한의 (주 3) mitochondrial 호흡 들어, 25μL 해밀턴 microsyringe를 사용하여, 5mM (포화)의 최종 농도에 대한 500mM ADP의 20μL를 추가 ADP의 그러나, 이상 90 % 포화에만 5mM 7 위 농도에 도달 수있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
- 안정적인 산소 소비량의 2 5 분 후, 외부 mitochondrial 멤브레인 (OMM) 무결성의 품질 관리 분석을위한, 10μL 해밀턴 microsyringe를 사용하여 10μM의 최종 농도를 구하는 4mm짜리 시토크롬 C의 5μL를 추가합니다.
- 안정적인 산소 소비량의 2 5 분 다음, ATP synthase의 억제하기 위해, 10μL 해밀턴 microsyringe를 사용하여 4mg / ML oligomycin의 1μL를 추가합니다. 이 적정 단계는 내부 mitochondria 멤브레인 intactness의 유효성 검사를 제공합니다.
- respirometric OXPHOS 평가에 따라. 예제는 건조 중량 또는 mitochondrial 마커 결정을 위해 유지됩니다.
- oxygraph의 유리 실에서 MiR05를 제거합니다. 증류수 (ddH 2 O)와 실 적어도 세 번 씻으십시오.
- 같은 oligomycin 같은 EtOH - 용해 억제제를 제거하는 100 % 에탄올 (EtOH)와 실 적어도 세 번 씻으십시오.
- oxygraph 챔버스을 소독하기 위해 지속 30 분 씻어 최종 70% EtOH로 70% EtOH 세 번있는 실 씻으십시오.
- 새로운 실험 적정 프로토콜 MiR05를 추가하기 전에 POS 들어있는 실이 ddH 2 O. 최소한 다섯 번이나 씻어 수 있도록
- 확인 titrations는 respirometry 연구의 실험 및 진단 목적에 따라 잘 계획 적정 프로토콜에 포함될 수 있습니다 개별 프로토콜 (그림 2) 또는 titrations으로 수행할 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
그림 2에서와 같이 제대로 준비 murine 심장 섬유의 산소 소비는 품질 관리 프로토콜에 의해 평가됩니다. 그림 3-5 잘못 준비 심장 섬유의 일반적으로 발생 사례를 제공합니다. 호흡 조절 비율 (RCR)는 respirometry에 중요한 인덱스를 나타냅니다. 이 매개 변수는 산소 소비와 산화 인산화 사이의 커플링을 나타냅니다. permeabilized 섬유 준비에서 RCR는 주 4 주 이상의 2 주 또는 3 주 3 상대 (oligomycin 및 / 또는 atractyloside, ATR에 의해 유도)에서 호흡의 속도입니다. 또한, RCR은 품질 보증 마커로 사용할 수 있으며, 실험 또는 병리 학적 개입에서 5를 발생하는 커플링의 변화를 확인할 수 있습니다. 잘 결합 permeabilized murine 심장 준비 1을 활용 부화 솔루션, 8, 9에 따라 3-6 사이의 RCR를 얻을 수 있습니다.
시토크롬 C의 적정는 적절한 조직 준비 유효성 검사로 사용됩니다. 시토크롬 C는 mitochondrial 내부 막 10 intermembrane 공간에있는 단백질이다. mitochondria의 외부 세포막이 손상되면, 내생 시토크롬 C는 intermembrane 공간에 남아 외인성 시토크롬 C의 적정는 호흡에 무시할 영향 (그림 2)를하고 있습니다. mitochondria의 외부 세포막이 손상된 경우, 내생 시토크롬 C는 intermembrane 공간에서 공개 수 있으며, 외인성 시토크롬 때까지 호흡을 억제합니다C 추가 (그림 3). 적절한 준비가 5~15% 범위 5 시토크롬 C 추가 다음과 산소 유량에만 약간의 상승을 경험한다. 또한이 실험 적정가 mitochondrial 외부 멤브레인 intactness에 병적인 또는 실험적 스트레스의 영향의 평가를 위해 수 있습니다. 시토크롬 C의 효과가 경험이있다면, 조직 및 / 또는 사포닌 농도를 감소의 기계적 준비하는 동안 신경을 보장합니다.
oligomycin 및 / 또는 ATR의 추가가 누출 호흡에 변경을 평가하는 데 사용되며 산소 소비량은 ADP의 인산화 11 기여하지 않습니다. 또한이 적정 단계는 적절한 샘플 준비 유효성 검사로 사용할 수 있습니다. 제어 또는 야생 형 섬유는이 이외에 민감하고 산소 유량에 상당한 감소를 경험해야합니다. 낮은 RCR과 비교적 높은 산소 유량의 결과 oligomycin 및 / 또는 ATR로 축소 감도는 준비하는 동안 내부 mitochondrial 멤브레인 (그림 4)에 손상을 나타냅니다. 내부 mitochondrial 멤브레인가 바깥 mitochondrial 멤브레인에 사포닌 상대적으로 모욕 적은 쉽습니다와 같은 손상 가능성이 심장병 섬유의 기계적 분리하는 동안 유도합니다. 그러나 두 기계적 및 화학적 준비 부적절하게 준비 심장 섬유 5, 12을 피하기 위해 따라 조정해야 할 수 있습니다.
생쥐에서 사포닌 피부 섬유 번들은 2 시간 이상의 이상의 6h 또는 MiR05 솔루션을위한 RP 솔루션에 남아해서는 안됩니다. 그림 5에서 볼 기판 - 억제 - uncoupler의 titrations에 응답의 부족은 장기 배양 기간을 나타내는 수 있습니다. 후속 노력은 동물의 희생과 산소 소비 측정 사이의 기간을 최소화해야합니다.
그림 1. murine 심장 섬유 번들의 기계적 준비. A. 전체 심장 즉시 다음과 같은 해부. B. 앞쪽에 좌심실의 10 25mg 샘플. C. 심장 조직은 1mm의 직경 2~4밀리미터 길이 스트립으로 구분합니다. 사포닌과 화학 permeabilization 준비 D. 최종 심장 섬유 몫이야.
그림 2. polarographic 평가를 활용하여 적절한 조직 준비 대표 결과입니다. 주 2 산소 유량은 복잡한 I 기판 글루 탐 산염 및 malate (M / G)에 의해 지원되며 크게 ADP의 추가 (주 3) 다음과 같은 자극합니다. 외인성 시토크롬 C 추가의 어떠한 stimulatory 효과는 외부 mitochondrial 멤브레인이 그대로 나타냅니다 없습니다. oligomycin에 산소 소비의 감도는 내부 mitochondrial 멤브레인 무결성이 그대로 나타냅니다. 2 ML 폐쇄 챔버의 산소 농도는 청색 선으로 식별됩니다. 2 ML 폐쇄 챔버에 심장 조직 샘플의 산소 소비가 빨간 선으로 표시됩니다. Malate 및 글루 탐 산염, M / G, 아데노신 Diphosphate, ADP, 시토크롬 C, C Cyto; Oligomycin, O.
polarographic 평가를 활용하여 그림 3. 시토크롬 C의 효과 검증 테스트. 주 2 산소 유량은 복잡한 I 기판 글루 탐 산염 및 malate (M / G)에 의해 지원되며 크게 ADP의 추가 (주 3) 다음과 같은 자극합니다. 외인성 시토크롬 C의 추가 Stimulatory 효과는 외부 mitochondrial 멤브레인 무결성이 손상을 나타냅니다. 2 ML 폐쇄 챔버의 산소 농도는 청색 선으로 식별됩니다. 2 ML 폐쇄 챔버에 심장 조직 샘플의 산소 소비가 빨간 선으로 표시됩니다. Malate 및 글루 탐 산염, M / G, 아데노신 Diphosphate, ADP, 시토크롬 C, Cyto C.
그림 4. polarographic 평가를 활용하여 내부 mitochondrial 막 무결성 검증 테스트. 주 2 산소 유량은 복잡한 I 기판 글루 탐 산염 및 malate (M / G)과 ADP의 추가 (주 3) 다음과 산소 소비의 비교적 약한 자극에 의해 지원됩니다. oligomycin에 산소 소비의 가난한 감성의 내면 mitochondrial 멤브레인이 손상된 것을 제안합니다. 2 ML 폐쇄 챔버의 산소 농도는 청색 선으로 식별됩니다. 2 ML 폐쇄 챔버에 심장 조직 샘플의 산소 소비가 빨간 선으로 표시됩니다. Malate 및 글루 탐 산염, M / G, 아데노신 Diphosphate, ADP Oligomycin, O.
그림 5. MiR05에서 장기간 배양 다음 Polarographic 평가. 산소 소비 (ADP의 추가 다음과 같은 외인성 글루 탐 산염과 malate를 추가 (M / G)와 산소 소비를 구분하지 않습니다주 3)으로 줄일 수있다. 외인성 시토크롬 C 추가 및 oligomycin에 산소 소비의 무감각에 대한 stimulatory 효과가 없다는 경험이다. extramitochondrial 부화 솔루션에 추가에 응답의 부족은 mitochondrial 기능과 안정성에 문제가있다 제안합니다. 2 ML 폐쇄 챔버의 산소 농도는 청색 선으로 식별됩니다. 2 ML 폐쇄 챔버에 심장 조직 샘플의 산소 소비가 빨간 선으로 표시됩니다. Malate 및 글루 탐 산염, M / G, 아데노신 Diphosphate, ADP, 시토크롬 C, Cyto C.
1. 참고 사항 : 시약 준비
K 2 EGTA 100mM 증권 솔루션의 준비
| 시약의 이름 | 최종 농도 (㎜) | g/100 ML H 2 O |
| 에틸렌 글리콜 - 비스 - (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N'- tetraacetic 산 (EGTA) | 100 | 3.805 |
| 수산화 칼륨 (코) | 200 | 1.15 |
참고 : 상온에서 7.4으로 산도를 조정합니다.
칼슘이 EGTA 100mM 증권 솔루션의 준비
| 시약의 이름 | 최종 농도 (㎜) | g/100 ML H 2 O | 댓글 (옵션) |
| 에틸렌 글리콜 - 비스 - (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N'- tetraacetic 산 (EGTA) | 100 | 3.805 | 80 열 ° C와 약간 저어. |
| 탄산 칼슘 (CaCO 3) | 100 | 1.001 | 칼슘은 mitochondria 등 다양한 organelles의 기능을 조절함에 따라 칼슘 농도가 정확해야합니다. 모든 CaCO 3 전체 solubilization을 보장합니다. 최종 솔루션은 완전히 투명해야합니다. CaCO 3는 초기에 탄산과 CO 2 증발의 형성을 활성화 EGTA과 물 혼합이다. 이 반응은 80 가열에 의해 가속 수 있습니다 ° C. |
| 수산화 칼륨 (코) | 200 | 1.15 | CO 2의 증발이 완료된 후 코와 중화. |
참고 : 상온에서 7.4으로 산도를 조정합니다.
휴식과 보존 솔루션 (RP 솔루션) 1 준비
| 시약 | 최종 농도 (㎜) | 리터 당 | 댓글 |
| K 2 EGTA | 7.23 | 72.3 ML | |
| CaK 2 EGTA | 2.77 | 27.7 ML | |
| 이미다졸 | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0.5 | ||
| 타우린 | 20 | 2.52g | |
| 아데노신 5' - 삼인산 나트륨 소금 하이드 레이트 (ATP) | 5.7 | 3.14g | |
| Phosphocreatine (PCR) | 14.3 | 4.0g | |
| 마그네슘 염화물 (MgCl 2) | 6.56 | 0.624g | |
| K - MES | 50 | 14.0g |
참고 : 상온에서 7.1로 pH를 조정
Mitochondrial Respirometry 솔루션의 작성 (MiR05 솔루션) 2
| 시약 | 최종 농도 (㎜) | 리터 당 | 댓글 (옵션) |
| 에틸렌 글리콜 - 비스 - (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N'- tetraacetic 산 (EGTA) | 0.5 | 0.190g | 칼슘의 chelator로 사용 |
| 마그네슘 염화 hexahydrate (MgCl 2 0.6 H 2 O) | 3.0 | 0.610g | 섬유 준비의 품질은 MG이없이 테스트할 수 없습니다 +. |
| 타우린 | 20.0 | 2.502g | 타우린은 멤브레인 안정제와 산화 방지제이다. 20mM 중심부에 존재하는 세포내 농도입니다. |
| 인산 칼륨 일염기의 (KH 2 PO 4) | 10.0 | 1.361g | |
| 20.0 | 4.77g | ||
| 칼륨 - lactobionate | 60.0 | 0.5 M 120 ML K - lactobionate 재고 | 0.5M K - lactobionate 재고 : 100 ML H 2 O 및 RT에서 7.0으로 산도에 35.83 g lactobionic 산성을 추가합니다. ddH 2 O. 200 ML에 볼륨을 조정 높은 세포내 K +는 농도를 복제하는 데 사용됩니다. 이전 KCl을 사용했습니다, 그러나, 높은 mitochondrial 크레아틴 키나제 기능 Club 호텔은 - 억제. |
| 자당 | 110.0 | 37.65g | ROS의 청소로 사용됩니다. |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 1g / L | 1g | 막 안정제, 산화 방지제, 그리고 칼슘과 자유 지방산의 chelator로 사용됩니다. |
참고 : 30 ° C에서 7.1로 pH를 조정
3. 참고 사항 : Respirometric OXPHOS 분석
B. 선택 기판, uncouplers 및 억제제
Mitochondrial Respirometry 분석 선정 기판 목록
| 기판 | [증권] | 준비 | 2 ML 당 볼륨 | [최종] | 댓글 |
| 아데노신 5' - diphosphate의 monopotassium 소금 이수화물 (ADP) | 500mM | 246mg / ML ddH 2 O. RT에서 7.1로 산도를 조정합니다. -80 °에서 보관 250 μL aliquots에서 C. | 20ul | 5mM | 유지하기 위해 지속적인 MG 2 + + respirometry 실험 기간 동안 0.6 몰 MgCl 2 / 몰 ADP를 추가합니다. |
| 아스코 브 | 800mM | 0.1584g / ML ddH 2 O. 200 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. 민감한 라이트 | 5 μL | 2mM | 기판 역할을 TMPD과 병행하여 사용됩니다. 자동 산화에 대한 산소 유량에 대한 수정해야합니다. |
| 시토크롬 C | 4mm짜리 | 50mg / ML ddH 2 O. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 5 μL | 10uM | |
| 시안화물 카르보닐 P - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | 0.1mM | 0.254mg/10 ML 100 % EtOH. 500 μL aliquots에서 -20 ° C에서 유리 튜브 안에 저장합니다. | 1 μL의 단계 | uncoupler 역할을합니다. 최대한의 전자 수송 용량 및 인산화 시스템으로 전자 전송의 한계를 결정합니다. | |
| 글루 탐 산염 | 2M | 0.3742g / ML ddH 2 O. RT에서 7.1로 산도를 조정합니다. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 10ul | 10mM | NADH 탈수소 효소의 기판 역할을 (복잡한 I). |
| Malate | 800mM | 0.1073g / ML ddH 2 O. RT에서 7.1로 산도를 조정합니다. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 5ul | 2mM | NADH 탈수소 효소의 기판 역할을 (복잡한 I). 혼자 호흡을 지원할 수 없습니다. |
| Pyruvate | 1M | 11mg/0.1 ML ddH 2 O. 신선한 준비합니다. | 5 μL | 2.5mM | NADH 탈수소 효소의 기판 역할을 (복잡한 I). |
| Succinate | 1000mM | 1.3505g / 5 ML ddH 2 O. RT에서 7.1로 산도를 조정합니다. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 20ul | 10mM | succinate 탈수소 효소 (복잡한 II)의 기판 역할을합니다. |
| N, N, N ', N' - Tetramethyl - pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | 200mM | 47.1mg / ML ddH 2 O. 200 μL aliquots에서 -20 ° C에서 자동 산화 저장을 방지하기 위해 10mM의 최종 농도 0.8M 아스코 브를 추가합니다. | 5 μL | 0.5mM | 푸른 색채의 외관에 의해 분명 재고 솔루션 Autoxidation. 기판 역할을 TMPD과 병행하여 사용됩니다. 자동 산화에 대한 산소 유량에 대한 수정해야합니다. |
Mitochondrial Respirometry 분석 선정 억제제 목록
| 기판 | [증권] | 준비 | 2 ML 회의소 당 볼륨 | [최종] | 댓글 |
| Antimycin | 5mM | 27.4mg/10 ML 100 % EtOH. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 1 μL | 2.5μM | 보조 효소의 억제제 Q : 시토크롬 C 산화 환원 효소 (복합 III) </ TD> |
| Atractyloside | 50mM | 40mg / ML ddH 2 O. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 30 μL | 0.75mM | ATP의 Synthase의 억제제. |
| Oligomycin | 4mg / ML | 4mg / ML 100 % EtOH. 200 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. | 1 μL | ATP synthase의 저해제. | |
| 시안화 칼륨 | 1M | 65.1mg / ML ddH 2 O. 신선한 준비합니다. RT에서 7.1로 산도를 조정 | 1 μL | 1mM | 시토크롬 C 산화 효소의 억제제 (복잡한 IV). 다음 TMPD 및 autoxidation에 액세스하는 아스코 브 적정을 활용한다. |
| Rotenone | 0.1mM | 0.39mg/10 ML 100 % EtOH. 250 μL aliquots에서 -20 ° C에 보관하십시오. 민감한 라이트. | 1 μL | 0.05μM | NADH 탈수소 효소의 억제제 (복잡한 I). 높은 농도는 같은 설명 시작 챔버에서 rotenone 보존을 줄이기 위해, 그러나 필요할 수 있습니다. |
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Discussion
사포닌 - permeabilized 심장 섬유 기술은 체외에서 mitochondrial OXPHOS 산소 소비의 생체내 평가 사이에 독특한 타협을 제공합니다. 이 기법의 장점은 보존되어 있습니다 셀룰러 아키텍처로 격리 mitochondria에 비해 생리 관련을 증가 등이 있습니다. 플라즈마 막이 저하되는 동안, mitochondria 12를 포함하여 세포 멤브레인 구조, 14, sarcoplasmic reticulum 14, 근육 섬 유지 및 cytoskeleton 1, 17 그대로 남아 있습니다. 또한, mitochondria 및 cytoskeleton 일, 17 사이의 상호 작용도 변형입니다. permeabilized 섬유의 Mitochondria가 증가 안정성을 보여줍니다. 설치류 섬유 준비는 최대 24 시간 18,2하는 안정성을 보여주 6h 인간 섬유 샘플 얼음처럼 차가운 preservations 솔루션에 저장할 수 있습니다. 부화 솔루션 Mitochondria 경험 빠른 평균. 이것은 추가 기판, 억제제 및 uncouplers 1, 5에 대한 응답으로 전자 전송 체인의 특정 사이트 분석을 통해 직접 관리할 수 있습니다. 또한, 현장 기술이이 조직의 몇 밀리그램이 필요합니다.
사포닌 피부 섬유 기술의 한계는 무시하실 수 없습니다. 심장 mitochondria 두 subpopulations 구성된 이기종되며. subsarcolemmal 및 interfibrillar 현장 mitochondrial respirometry 관련 subpopulations 5 구별하는 능력없이는 전체 인구 mitochondrial을 평가합니다. 또한, 다양한 세포 metabolites과 cytosolic 요소 mitochondrial 기능을 조절. 심장 섬유 이러한 cytosolic 구성 요소는 생체내 환경 5 정확한에서 mitochondrial 평가하는 무능력의 결과 permeabilization 과정에서 손실됩니다.
보고 문제가 중요한 관심사입니다. 산소 소비 측정이 서부 유럽 표준시 무게 또는 건조 중량 당 표현 수 있습니다 단, mitochondrial 밀도 조직 질량 7 회 표현 호흡기 플럭스 이질의 주요 요인입니다. 호흡 속도와 변화 크게 참조 상태의 선택에 의해 영향의 해석을 이해하는 것이 중요합니다. permeabilized 섬유의 respirometric OXPHOS 결과를 직접 비교, 요금 등 mitochondrial DNA, 구연 산염의 synthase 활동, 시토크롬 C 산화 효소 활동, 및 / 또는 시토크롬 aa3 내용 19로 일반 참조 표식에 상대를 표현합니다.
요약, respirometry 분석과 함께 사용 permeabilized 섬유 준비 심장 mitochondria의 통합 기능의 평가를 위해 수 있습니다. 다양한 병적인 상태 및 유전 모델은이 기술을 활용합니다. 이들은 약물 유발 독성의 평가, 노화, 당뇨병, 울혈 심장 마비, 허혈성 부상 mitochondrial 생리학 5, 20 산화 스트레스를 포함합니다. 여러 훌륭한 방법 론적 검토하고 사포닌 - permeabilized 섬유 기술과 polarographic 산소 소비량 평가의 원고는 이전 1, 5, 14, 20 출판되어 있고 추천할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 건강 연구와 게놈 캐나다의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. JS는 의료 연구, 심장과 캐나다의 행정 재단과 캐나다 당뇨병 협회 앨버타 헤리티지 재단의 급여 지원 수상 경력을 보유하고 있습니다. 실험실은 사포닌 - permeabilized 섬유 기술의 인수 중에 Oroboros 악기의 기술 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
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