Summary
Söz konusu modelde oksidatif fosforilasyon analizi ile birlikte Saponin-permeabilize elyaf hazırlama, mitokondriyal fonksiyon bütünleştirici değerlendirme sağlar. Mitokondriyal solunum fizyolojik ve patolojik durumlar mitokondriyal etkileşimleri, morfolojisi ve biyokimya da dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici etkileri yansıtabilir.
Abstract
Mitokondri, enerji metabolizması, oksidatif stres, apoptoz, yaşlanma, mitokondriyal encephalomyopathies ve ilaç toksisitesinin yer olarak mitokondriyal fonksiyon araştırılması kalp fizyolojisi önemli bir parametre temsil eder. Bu göz önüne alındığında, kalp mitokondrial fonksiyonu ölçmek için teknolojiler talep vardır. Mitokondrial fonksiyonu ölçmek için bütüncül bir yaklaşım kullanır Bir teknik Söz konusu modelde oksidatif fosforilasyon (Kadıköy) analizi.
Söz konusu modelde Kadıköy değerlendirme ilkesi Clark elektrot kullanan oksijen konsantrasyonu ölçüm etrafında merkezli. Permeabilize elyaf demeti, kapalı oda düşüşler, oksijen, oksijen konsantrasyonu tüketir. Seçilen substrat inhibitörü-uncoupler titrasyon protokolleri kullanarak, elektronlar, mitokondriyal fonksiyon değerlendirme sağlayan, elektron taşıma zinciri belirli siteleri sağlanmaktadır. Kas liflerinin sarcolemma permeabilize, mitokondriyal fonksiyon modelde aynı analizi öncesinde mekanik ve kimyasal hazırlık teknikleri kullanılmaktadır. Kimyasal permeabilization hücresel mimarili korurken seçici hücre zarı perfore saponin kullanmaktadır.
Bu kağıt iyice mitokondriyal Kadıköy değerlendirmek için, oksijen tüketimi ölçümleri için saponin tenli kalp lifleri hazırlanmasında yer alan adımları açıklamaktadır. Ayrıca, danışmanlık hizmetlerinin yanı sıra özel substratlar gidermeye, elektron taşıma zinciri belirli siteleri mitokondri fonksiyonunu belirlemek için kullanılıyor olabilir inhibitörleri ve uncouplers sağlanmaktadır. Önemlisi, açıklanan protokol çeşitli hayvan modellerinde ve insan örnekleri kalp ve iskelet doku kolayca uygulanabilir.
Protocol
1. Reaktif Hazırlama
- Gevşeme ve koruma solüsyonu (RP Çözüm), daha önce açıklandığı gibi küçük değişiklikler 1 ile hazırlanmıştır . Kısaca, RP Çözüm arındırılmış 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20mm imidazol, 0.5mm dithiothreitol, 20mm taurin, 50mm K-MES, 6.56 MgCl 2, 5,7 mm ATP, 14.3mM phosphocreatine, pH 7.1, oda sıcaklığında (RT). 0.45 mikron filtre ile sterilize etmek için bir çözüm Filtresi. -20 15 ml porsiyon (Falcon polipropilen borular) ve mağaza içine Böl ° C yemek tarifleri için bakınız.
- Mitokondrial respirometri Çözümü (MiR05) hazırlanan ve daha önce 2 açıklandığı gibi, potasyum lactobionate 60mm, 110mm 0.5mm EGTA, 3mm MgCl 2 .6 H 2 O, 20mm taurin, 10mM KH 2 PO 4, 20mm Hepes 1g / L BSA, içeren 30 ayarlanabilir sakkaroz, pH 7.1 ° C. 0.45 mikron filtre ile sterilize etmek için bir çözüm Filtresi. -20 ° C'de 50 ml porsiyon (Falcon polipropilen borular) ve mağaza içine Böl Yemek tarifleri için bakınız. 30 MiR05 için oksijen çözünürlüğü faktör ° C ve 37 ° C 0.92 3.
2. Doku hazırlanması
A. Kardiyak liflerin mekanik yüzey hazırlığı
- Prosedürler, Calgary Hayvan Bakım Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Komitesi kullanın ve Kanada Derneği Laboratuvar deneyleri için Zootekni kurallarına uymayı
- Servikal dislokasyon fare hareketsiz tercih edilen yöntemdir. Alternatif olarak, intraperotineal (IP), ketamin ve ksilizin enjeksiyon (sırasıyla% 80 ve 10mg/kg,) veya pentobarbital sodyum 0.5mg/kg uygulanabilir. Not: pentobarbital Sodyum NADH dehidrogenaz (karmaşık) 4 reversibl bir inhibitörüdür .
- Kalp çıkarın ve buz (Şekil 1A) RP çözümü içeren bir petri yemek yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu kullanarak herhangi bir bağ dokusu ve / veya yağ dikkatlice çıkartın.
- Septum boyunca yarısında kalp kesin. Sol ventrikül endokard yüzey (Şekil 1B) keserek doku çıkarılarak 10-25mg ıslak ağırlığı (ww). Miyokarda mekanik hasarı en aza indirmek için fiber oryantasyon boyunca olun kesi.
- Buz üzerinde RP çözümü içeren petri yemek ayrı bir doku disseke, alt örnek yerleştirin. Diseksiyon mikroskop kullanarak 1-1.5mm çapında fiber oryantasyon boyunca uzunlamasına şeritler halinde kalp kesti.
- 2-4mm (Şekil 1C) uzunlukları bir neşter ile şeritler kısaltın.
- Aşırı bakım ve mekanik ayrı lif demetleri keskin forseps kullanma. Final lif demetleri 5mg ww daha fazla ağırlıkta olan küçük alanlarda temas bağlı 6-8 liflerinin maksimum içermelidir. 1-3mg ww Kardiyak lifleri tavsiye edilir. Görme, kalp dokusu, soluk pembe renkli boyama (Şekil 1D) orijinal kırmızı değiştirmeniz gerekir.
B. Kardiyak lif demetleri kimyasal hazırlık
- Buz üzerinde 12 plaka koyun.
- RP 5 kalsiyum kontaminasyonu en aza indirmek için çözüm (ler) ile iyi durulayın.
- 50ug / ml saponin ile de içeren bir 3ml buz RP çözüm şerbetini lif demetleri aktarın. Not: saponin konsantrasyonu çözüm kalp kası mevcut miktarına bağlı değildir.
- Buz üzerinde hafif karıştırarak 20dk boyunca inkübe.
C. Kardiyak Fiber Demeti Yıkama
- 5 kalsiyum kontaminasyonu en aza indirmek için yeni bir de MiR05 ile durulayın.
- Buz gibi yeni de içeren 10 ml MiR05 kalp demetleri aktarın. Buz üzerinde hafif karıştırarak 10 dakika süreyle inkübe edin.
- Taze MiR05 tekrarlayın (1-2) 2-3 kez. Tekrarlayan yıkama adımları kaldırılması veya saponin, ATP, ADP ve lif demetleri kalan substratları sağlamak için.
D. Islak ağırlığı tayini
- Doğrudan solunum analiz önce, ıslak ağırlık, tek tek lif demetleri (1 3mg ww) forseps kullanarak emici bir yüzey (filtre kağıdı) blot ve 5s için yüzeye fiber tutan veya tüm nemi kötülerin kadar elde edilir.
- Başka bir emici yüzey kullanarak, forseps fazla sıvı çıkarın.
- Dara ölçek ve plastik bir elyaf demeti kitle ölçümü için tekne tartın.
- MiR05 buz yeni bir kuyu kalp elyaf demeti aktarın. Elyaf demeti oksijen tüketimi değerlendirilmesi için hazırdır.
3. Söz konusu modelde Kadıköy Analizi
A. Söz konusu modelde Ekipmanları
- Laboratuar, iki odalı bir titrasyon enjeksiyon oxygraph kullanır ve tavsiye (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). Oxygraph 2-k büyük ölçüde katkıda enstrümantal arka plan en aza indirir enstrümantal donanım ve yazılım (DatLab) kullanılarak yüksek çözünürlüklü respirometrioksijen tüketimi eserler.
- Oxygraph Kalibrasyon enstrümantal oksijen tüketimi karıştırıcı etkilerini en aza indirmek için önemli bir adımdır. Kalibrasyon oxygraph bağlı olarak biraz değişir. Belirli prosedürleri için oxygraph kullanım kılavuzuna başvurun.
B. Temsilcisi Kalite Kontrol / Teknik Doğrulama Protokolü
- MiR05 polarografik oksijen sensörleri (POS) ve 37 MiR05 hava doygunluğu ve dengelenme için yeterli zaman vermek ° C önceden oxygraph odaları içine fare kalp lifler koyarak oxygraph odaları konut eklenmiştir olun.
- Kalp lif örnekleri oxygraph odaları karıştırılır MiR05 yerleştirilir. Not: heyecan bar olun PVDF veya PEEK-kaplı karıştırıcı çubuklar (6mm çap).
- Oksijen dolu bir şırınga kullanarak, 250-550uM oxygraph odaların oksijen konsantrasyonu artırır. Oksijen konsantrasyonu hava doygunluğu 6 üzerinde bile% 50 permeabilize fiber hazırlıkları için sınırlayıcı olduğunu belirtmek gerekir. 5-10dk oksijen konsantrasyonu istikrar için izin ver.
- 25μL Hamilton mikroenjektör kullanarak, sırasıyla, 10mM ve 2mm son bir konsantrasyon elde etmek için 800mm malat 2M glutamat ve 5μL 10μL ekleyin. Bu titrasyonları belirlenmesi için bazal kompleksi Ben destekli solunumu (ADP yokluğunda Devlet 2) izin verir. Oksijen akı titrasyon yaklaşık 5 dk içinde stabilize edilmelidir. Uygun hazırlık, 2 oksijen tüketimi çok tekrarlanabilir devlet vermelidir.
- Istikrarlı oksijen tüketimi 2-5sn sonra, karmaşık I. Az sayıda çalışmada ise bu kadar yüksek bir konsantrasyon kullanımı yoluyla maksimum (state 3), mitokondriyal solunum, 25μL Hamilton mikroenjektör kullanarak, 5mM (doyurarak) son bir konsantrasyon için 500mm ADP 20μL eklemek ADP, ancak, sadece% 90 daha fazla doygunluk 5mM 7 üstündeki yoğunluklara ulaşmış olduğunu not etmek önemlidir.
- Sabit oksijen tüketimi 2-5sn sonra, dış mitokondriyal membran (OMM) bütünlüğünü kalite kontrol analizi için, bir 10μL Hamilton mikroenjektör kullanarak 10μM bir final konsantrasyon elde etmek için 4mm sitokrom c 5μL ekleyin.
- Sabit oksijen tüketimi 2-5sn sonra, ATP sentaz inhibe 10μL Hamilton mikroenjektör kullanarak, 4 mg / ml oligomycin 1μL ekleyin. Bu titrasyon adım iç mitokondri membran sağlamlık doğrulama sunacak.
- Söz konusu modelde Kadıköy değerlendirmenin ardından. Kuru ağırlık veya mitokondriyal işaretleyici belirlenmesi için örnek korunur.
- Oxygraph cam odalarından MiR05 çıkarın. Distile su (GKD 2 O) odaları en az üç kez yıkayın.
- Odaları gibi oligomycin EtOH çözünen inhibitörleri kaldırmak için% 100 etanol (EtOH) ile en az üç kez yıkayın.
- Oxygraph odalarına sterilize etmek için kalıcı 30 dakika yıkayın odaları, final% 70 EtOH ile% 70 EtOH üç kez yıkayın.
- Yeni deneysel titrasyon protokol için ek MiR05 önce POS içeren odaları GKD 2 O. ile birlikte en az beş kez yıkanmış sağlamak
- Doğrulama titrasyonları, respirometri çalışmaların deneysel ve teşhis amaçları bağlı olarak iyi planlanmış titrasyon protokol içine dahil edilebilir (Şekil 2) tek bir protokol veya titrasyonları olarak yapılabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 2'de gösterildiği gibi, doğru hazırlanmış bir fare kalp liflerinde oksijen tüketimi, kalite kontrol protokolü tarafından değerlendirilir. Rakamlar 3-5 yanlış hazırlanmış kalp liflerinin sık karşılaşılan örnekler sağlar. Solunum kontrol oranı (RCR) önemli bir respirometri endeksi temsil eder. Bu parametre, oksijen tüketimi ve oksidatif fosforilasyon arasındaki kaplin gösterir. Permeabilize lif hazırlıkları, RCR devlet 4 üzerinden devlet 3 devlet 2 ya da alternatif olarak devlet 3 akrabası oligomycin ve / veya atractyloside, ATR tarafından uyarılan solunum oranıdır. Ayrıca, RCR bir kalite güvence belirteci olarak kullanılan olabilir ve deneysel ya da patolojik müdahaleler ila 5 kaplin değişiklikleri tanımlayabilir. İyi çiftli permeabilize fare kalp hazırlıkları 1 kullanılan kuluçka çözüm, 8, 9 bağlı olarak 3-6 arasında bir RCR verim .
Sitokrom c titrasyonu uygun doku hazırlanması bir doğrulama olarak kullanılır. Sitokrom c mitokondrial iç zarı 10 arası boşlukta bulunan bir protein. Mitokondri dış zarı sağlam olduğunda, endojen sitokrom c arası boşlukta kalır ve eksojen sitokrom c titrasyon solunum ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir (Şekil 2). Mitokondri dış zarı hasar görürse, endojen sitokrom c arası boşlukta serbest ve eksojen sitokrom kadar solunum inhibec ek (Şekil 3). Uygun hazırlıkları% 5-15 aralığı 5 sitokrom c Ayrıca oksijen akı sadece hafif bir yükseklik deneyimine sahip olmaları gerekmektedir. Ayrıca, bu deneysel titrasyon mitokondrial dış membran sağlamlık, patolojik ya da deneysel stres etkisinin değerlendirilmesi için sağlar. Sitokrom c etkisi yaşıyorsanız, doku ve / veya saponin konsantrasyonunu azaltmak mekanik hazırlanması sırasında bakım sağlamak.
Oligomycin ve / veya ATR Ayrıca kaçak solunum değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır; oksijen tüketimi ADP fosforilasyon 11 katkıda değil. Ayrıca, bu titrasyon adımı doğru numune hazırlama bir doğrulama olarak kullanılıyor olabilir. Kontrol veya yabani tip lifler bu ek duyarlı ve oksijen akı önemli bir düşüş deneyimi olmalıdır. Düşük RCR ve nispeten yükselmiş oksijen akı ile sonuçlanan oligomycin ve / veya ATR duyarlılığı azalmış hazırlanması sırasında iç mitokondrial membran (Şekil 4) zarar gösterir. Hasar muhtemelen iç mitokondrial membran dış mitokondrial membran saponin akrabası tarafından hakaret daha az duyarlı olduğu gibi kardiyak liflerin mekanik ayırma sırasında meydana gelir. Ancak, hem mekanik hem de kimyasal hazırlama, yanlış hazırlanmış kalp lifler 5, 12 önlemek için buna göre ayarlanmalıdır olabilir.
Farelerden elde edilen saponin tenli lif demetleri, 2 saat daha fazla fazla 6h veya MiR05 çözüm için RP çözüm kalmamalıdır. Şekil 5 de görüldüğü gibi substrat-inhibitör-uncoupler titrasyonları yanıt eksikliği uzun kuluçka dönemleri göstergesi olabilir. Sonraki çabalar hayvan kurban ve oksijen tüketimi ölçümleri arasındaki dönemlerde en aza indirmek gerekir.
Şekil 1 fare kalp lif demetleri Mekanik hazırlanması. A. tüm kalp hemen ardından diseksiyon. B. ön sol ventrikül 10-25mg örnek. C. Kardiyak doku 1mm çap ve 2-4mm uzunluğunda şeritler ayrılır. Saponin ile kimyasal permeabilization hazır D. Nihai kalp lif demetleri.
Şekil 2 polarografik değerlendirme yararlanarak uygun doku hazırlanması Temsilcisi sonuçları. Devlet 2 oksijen akı karmaşık I yüzeylerde glutamat ve malat (M / G) tarafından desteklenen ve ADP (devlet 3) yanı sıra önemli ölçüde uyarılır. Eksojen sitokrom c Ayrıca hiçbir uyarıcı etkisi dış mitokondrial membran sağlam olduğunu gösterir. Oksijen tüketimi oligomycin duyarlılığı iç mitokondrial membran bütünlüğünün bozulmamış olduğunu göstermektedir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G, Adenozin difosfat, ADP, Sitokrom c, Cyto c; Oligomycin, o.
Şekil 3 polarografik değerlendirme kullanan Sitokrom c etkisi doğrulama testi. Devlet 2 oksijen akı karmaşık I yüzeylerde glutamat ve malat (M / G) tarafından desteklenen ve ADP (devlet 3) yanı sıra önemli ölçüde uyarılır. Eksojen sitokrom c ek uyarıcı etkisi dış mitokondrial membran bütünlüğünde bir bozulma olduğunu gösterir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G Adenozin difosfat, ADP, Sitokrom c, Cyto c.
Şekil 4 polarografik değerlendirme kullanan iç mitokondrial membran bütünlüğünü doğrulama testi. Devlet 2 oksijen akı karmaşık I yüzeylerde glutamat ve malat (M / G) ve ADP (devlet 3) Ayrıca, oksijen tüketimi nispeten zayıf stimülasyon tarafından desteklenmektedir. Oligomycin oksijen tüketimi Kötü hassasiyet iç mitokondrial membran hasar olduğunu göstermektedir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G, Adenozin difosfat, ADP Oligomycin, o.
Şekil 5 Polarografik değerlendirme MiR05 uzun süreli inkübasyon aşağıdaki. Oksijen tüketimi (ADP Ayrıca aşağıdaki eksojen glutamat ve malat ek (M / G) ve oksijen tüketimi duyarsızstate 3) azalır. Eksojen sitokrom c toplama ve oksijen tüketimi oligomycin duyarsızlık hiçbir uyarıcı etkisi vardır yaşadı. Extramitochondrial inkübasyon çözümü eklemeler yanıt eksikliği mitokondrial fonksiyonel istikrarı tehlikeye göstermektedir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G Adenozin difosfat, ADP, Sitokrom c, Cyto c.
1. Notlar: Reaktif Hazırlama
K 2 EGTA 100 mM Stok Çözüm hazırlanması
| Reaktifin Adı | Final Konsantrasyon (mM) | g/100 mL H 2 O |
| Etilen glikol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) | 100 | 3,805 |
| Potasyum hidroksit (KOH) | 200 | 1,15 |
Not: oda sıcaklığında pH 7.4 'e ayarlayın.
Ca 2 EGTA 100 mM Stok Çözüm hazırlanması
| Reaktifin Adı | Final Konsantrasyon (mM) | g/100 mL H 2 O | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Etilen glikol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) | 100 | 3,805 | Isı 80 ° C ve hafif karıştırın. |
| Kalsiyum Karbonat (CaCO 3) | 100 | 1,001 | Kalsiyum konsantrasyonunu kalsiyum mitokondri de dahil olmak üzere çeşitli organellerin işlevi düzenler gibi hassas olmalıdır. Tüm CaCO 3 tam çözünürleştirme olun. Nihai çözüm tamamen şeffaf olmalıdır. CaCO 3 başlangıçta, karbonik asit ve CO 2 buharlaşma oluşumunu aktive etmek için EGTA ve biraz su ile karıştırılır . Bu reaksiyon, 80 ısınma hızlandırılmış olabilir ° C |
| Potasyum hidroksit (KOH) | 200 | 1,15 | CO 2 buharlaşma tamamlandıktan sonra KOH ile nötralize edin. |
Not: oda sıcaklığında pH 7.4 'e ayarlayın.
Gevşeme ve Koruma Çözümü (RP Çözüm) 1 hazırlanması
| Reaktif | Final Konsantrasyon (mM) | Litre başına | Yorumlar |
| K 2 EGTA | 7,23 | 72.3 ml | |
| CAK 2 EGTA | 2,77 | 27.7 ml | |
| Imidazol | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0,5 | ||
| Boğa | 20 | 2.52g | |
| Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuz hidrat (ATP) | 5,7 | 3.14g | |
| Fosfokreatin (PCr) | 14,3 | 4.0g | |
| Magnezyum klorür (MgCl 2) | 6,56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
Not: oda sıcaklığında pH 7.1 'e ayarlayın.
Mitokondrial respirometri Çözüm Hazırlığı (MiR05 Çözüm) 2
| Reaktif | Final Konsantrasyon (mM) | Litre başına | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Etilen glikol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) | 0,5 | 0.190g | Kalsiyum şelasyon olarak kullanılır. |
| Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl 2 .6 H 2 O) | 3,0 | 0.610g | Elyaf hazırlama kalitesi, Mg 2 olmadan test + . |
| Boğa | 20,0 | 2.502g | Taurin, bir zar sabitleyici ve antioksidan. 20mm kalp hücre içi konsantrasyonu. |
| Tekbazlı potasyum fosfat (KH 2 PO 4) | 10,0 | 1.361g | |
| 20,0 | 4.77g | ||
| Potasyum-lactobionate | 60,0 | 0.5 M 120 mL K-lactobionate hisse senedi | 0,5 M K-lactobionate Stok: 35.83 g lactobionic asit 100 mL H 2 O ve RT 7.0 pH ekleyin. GKD 2 O. ile 200 ml hacim ayarlama Yüksek intrasellüler K + konsantrasyonu çoğaltmak için kullanılır. Daha önce KCl kullanılan, ancak, yüksek mitokondriyal kreatin kinaz fonksiyonu Cl-engeller. |
| Sakaroz | 110,0 | 37.65g | ROS çöpçü olarak kullanılır. |
| Sığır Serum Albumin (BSA) | 1g / L | 1g | Membran stabilizatör, antioksidan ve serbest yağ asitleri, kalsiyum ve şelasyon olarak kullanılır. |
Not: 30 ° C'de pH 7.1 'e ayarlayın.
3. Notlar: Söz konusu modelde Kadıköy Analizi
B. seçin Substratlar, uncouplers ve inhibitörleri
Mitokondrial respirometri Analiz için seçilen Substratlar Listesi
| Yüzey | [Stok] | Hazırlık | 2 ml başına hacmi | [Final] | Yorumlar |
| Adenozin 5'-difosfat monopotasyum tuz dihidrat (ADP) | 500mm | 246mg / ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. Saklayınız -80 ° C 250 mcL alikotları. | 20ul | 5mM | Korumak için sürekli Mg 2 + + respirometri deneyler sırasında 0.6 mol MgCl 2 / mol ADP ekleyin. |
| Askorbat | 800mm | 0.1584g / ml GKD 2 O. 200 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. Işığa karşı hassastır | 5 mcL | 2mm | Substrat olarak etki TMPD ile paralel olarak kullanılır. Oto-oksidasyon için oksijen akı düzeltmeniz gerekir. |
| Sitokrom C | 4mm | 50 mg / ml GKD 2 O. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 5 mcL | 10uM | |
| Siyanür Karbonil p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | 0.1mm | 0.254mg/10 mL% 100 EtOH. Cam şişe, 500 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 1 mcL Adımlar | Bir uncoupler gibi davranır. Maksimum elektron taşıma kapasitesi ve elektron taşıma fosforilasyon sistemi tarafından herhangi bir sınırlama belirler. | |
| Glutamat | 2M | 0.3742g / ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 10ul | 10mM | NADH dehidrogenaz için bir substrat görevi görür (karmaşık). |
| Malate | 800mm | 0.1073g / ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 5ul | 2mm | NADH dehidrogenaz için bir substrat görevi görür (karmaşık). Yalnız solunum destek olamaz. |
| Piruvat | 1M | 11mg/0.1 ml GKD 2 O. Taze hazırlayın. | 5 mcL | 2.5mm | NADH dehidrogenaz için bir substrat görevi görür (karmaşık). |
| Succinat | 1000mm | 1.3505g / 5 ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 20ul | 10mM | Süksinat dehidrogenaz (karmaşık II) için bir substrat olarak görür. |
| N, N, N ', N'-tetramethyl pphenylenediamine Dihidroklorür (TMPD) | 200mm | 47.1mg / ml GKD 2 O. -20 ° C'de 200 mcL alikotları oto-oksidasyon Mağaza önlemek için 10mM son konsantrasyon 0.8M askorbat ekleyin. | 5 mcL | 0.5mm | Mavi renk görünümü belirgin stok solüsyonu oksidasyon. Substrat olarak etki TMPD ile paralel olarak kullanılır. Oto-oksidasyon için oksijen akı düzeltmeniz gerekir. |
Mitokondrial respirometri Analiz için seçilen İnhibitörleri Listesi
| Yüzey | [Stok] | Hazırlık | 2 ml Odası başına hacmi | [Final] | Yorumlar |
| Antimycin A | 5mM | 27.4mg/10 mL% 100 EtOH. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 1 mcL | 2.5μM | Koenzim Q: sitokrom c oksidoredüktaz (Kompleks III) inhibitörü </ Td> |
| Atractyloside | 50mm | 40 mg / ml GKD 2 O. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 30 mcL | 0.75mm | ATP sentaz inhibitörüdür. |
| Oligomycin | 4 mg / ml | 4 mg / ml% 100 EtOH. 200 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. | 1 mcL | ATP sentaz inhibitörüdür. | |
| Siyanür Potasyum | 1M | 65.1mg / ml GKD 2 O. Taze hazırlayın. RT pH 7.1 'e ayarlayın | 1 mcL | 1mm | Sitokrom c oksidaz inhibitörü (karmaşık IV). Aşağıdaki TMPD ve oksidasyon erişmek için Askorbat titrasyon yararlanın. |
| Rotenone | 0.1mm | 0.39mg/10 mL% 100 EtOH. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. Işığa karşı hassastır. | 1 mcL | 0.05μM | NADH dehidrogenaz inhibitörü (karmaşık). Ancak, daha yüksek konsantrasyonlarda olarak özetlenen başlamak odasında rotenone tutma azaltmak için gerekli olabilir. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saponin permeabilize kalp fiber tekniği, in vitro ve in vivo olarak değerlendirilmesi mitokondriyal Kadıköy oksijen tüketimi arasında eşsiz bir uzlaşma sunuyor. Bu tekniğin avantajları korunur hücresel mimarisi olarak izole mitokondri göre fizyolojik önemi artan içerir. Plazma zarı bozulmuş olsa da, mitokondri 12 olmak üzere hücre içi membran yapılar, 14, sarkoplazmik retikulum 14, myofilaments ve 1, 17 hücre iskeleti bozulmadan kalır . Ayrıca, mitokondri ve hücre iskeletinin 1, 17 arasındaki etkileşimleri de değişmez. Mitokondri permeabilize lifleri artan kararlılık göstermektedir. Kemirgen lif hazırlıkları 24 saat 18,2 için kararlılık gösteren ve insan 6h lif örnekleri için buz preservations çözümler saklanan olabilir. Mitokondri deneyim inkübasyon çözümü ile hızlı bir şekilde dengeleme. Bu siteye özgü analiz elektron taşıma zinciri eklendi substratı, inhibitörü ve uncouplers 1, 5 yanıt üzerinde doğrudan kontrol sağlar. Ayrıca, yerinde tekniğinde bu doku sadece birkaç miligram gerektirir.
Saponin tenli fiber tekniği sınırlamaları göz ardı edilemez. Kardiyak mitokondri, iki alt popülasyonlar oluşan heterojen. Subsarcolemmal ve interfibriller yerinde mitokondriyal respirometri 5 alt popülasyonlar arasında ayrım yeteneği olmadan mitokondriyal toplam nüfusun değerlendirir. Ayrıca, çeşitli hücresel metabolitleri ve sitozolik faktörler mitokondriyal fonksiyonu düzenler. Bu kalp liflerinin sitozolik bileşenleri, in vivo ortamda 5 tam mitokondriyal değerlendirmek için yetersizlik sonucu permeabilization işlemi sırasında kaybolur .
Raporlama konularda çok önemli bir meseledir. Islak ağırlık veya kuru ağırlık başına oksijen tüketimi ölçümleri ifade edilebilir, ancak, mitokondrial yoğunluk doku kitlesi 7 başına ifade solunum heterojenite akışını önemli bir faktör. Solunum oranları ve referans devlet seçimi büyük ölçüde etkilenmiştir bu yorumu anlamak önemlidir. Söz konusu modelde Kadıköy sonuçları permeabilize lifleri doğrudan karşılaştırmalar için, oranlar, mitokondriyal DNA, sitrat sentaz aktivitesi, sitokrom c oksidaz aktivitesi ve / veya sitokrom aa3 içerik 19 gibi ortak bir referans işaretine göre ifade edilmelidir .
Özetle, respirometri analizi ile birlikte kullanılan permeabilize elyaf hazırlama kalp mitokondri bütünleştirici işlevi değerlendirmesi için olanak sağlar. Çeşitli patolojik ve genetik modellere bu tekniği kullanılır. Bu ilaca bağlı toksisite değerlendirilmesi, yaşlanma, diyabet, konjestif kalp yetmezliği, iskemik hasar ve mitokondriyal fizyoloji 5, 20, oksidatif stres sayılabilir. Saponin-permeabilize fiber tekniği ve polarografik oksijen tüketimi değerlendirmesi çok mükemmel metodolojik yorumlarını ve el yazmaları daha önce yayınlanmış 1, 5, 14, 20 olmuştur ve son derece tavsiye edilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Genom Kanada Enstitüsü tarafından desteklendi. JS, Alberta, Kanada Sağlık Araştırma, Kalp ve İnme Vakfı ve Kanada Diyabet Derneği Heritage Vakfı'ndan maaş desteği ödül tutar. Laboratuvar saponin permeabilize fiber tekniği kazanılması sırasında Oroboros Araçların teknik yardım kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
