Summary
Saponin-permeabilisierten Faseraufbereitung in Verbindung mit respirometrische oxidative Phosphorylierung Analyse bietet integrative Beurteilung der Funktion der Mitochondrien. Mitochondriale Atmung in physiologischen und pathologischen Zuständen kann reflektieren verschiedene regulatorische Einflüsse einschließlich mitochondrialer Interaktionen, Morphologie und Biochemie.
Abstract
Untersuchung der Funktion der Mitochondrien ist ein wichtiger Parameter der kardialen Physiologie als Mitochondrien im Energiestoffwechsel, oxidativen Stress, Apoptose, dem Altern, mitochondriale Enzephalomyopathien und Toxizität von Medikamenten beteiligt sind. Vor diesem Hintergrund werden Technologien zur kardialen Funktion der Mitochondrien Maßnahme verlangen. Eine Technik, die einen integrativen Ansatz verwendet, um die Funktion der Mitochondrien Maßnahme ist respirometrische oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Analyse.
Das Prinzip der respirometrische OXPHOS Beurteilung ist um die Messung der Sauerstoffkonzentration unter Verwendung einer Clark-Elektrode zentriert. Da die permeabilisierten Faserbündel verbraucht Sauerstoff, Sauerstoff-Konzentration in der geschlossenen Kammer abnimmt. Anhand ausgewählter Substrat-Inhibitor-Entkoppler Titration Protokolle, werden Elektronen auf bestimmten Seiten der Elektronen-Transportkette vorgesehen, der die Auswertung der mitochondrialen Funktion. Vor respirometrische Analyse der mitochondrialen Funktion, mechanische und chemische vorbereitende Techniken werden eingesetzt, um das Sarkolemm der Muskelfasern permeabilisieren. Chemische Permeabilisierung beschäftigt Saponin, um selektiv zu perforieren die Zellmembran unter Beibehaltung zellulären Architektur.
Dieses Papier beschreibt ausführlich die Schritte bei der Vorbereitung Saponin-Haut Herz-Fasern für den Sauerstoffverbrauch Messungen der mitochondrialen OXPHOS bewerten beteiligt. Darüber hinaus Tipps zur Fehlerbehebung sowie spezifische Substrate, Inhibitoren und Entkuppler, die zur Mitochondrien-Funktion an bestimmten Standorten der Elektronen-Transportkette zu bestimmen sein kann. Wichtig ist, können die beschriebenen Protokoll leicht zu Herz-und Skelett-Gewebe von verschiedenen Tiermodellen und humanen Proben angewendet werden.
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Die Entspannung und Erhaltung Lösung (RP Solution) wird wie bisher mit geringfügigen Modifikationen 1 beschrieben. Kurz gesagt, besteht die RP-Lösung von 2.77mm CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 mM Imidazol, 0,5 mM Dithiothreitol, 20 mM Taurin, 50 mM K-MES, 6,56 MgCl 2, 5,7 mm ATP, 14.3mm Phosphokreatin, pH 7,1, eingestellt bei Raumtemperatur (RT). Filter die Lösung durch ein 0,45-um-Filter zu sterilisieren. Teilen Sie sich in 15 mL Portionen (Falcon Polypropylenröhrchen) und bei -20 ° C Siehe die Diskussion für Rezepte.
- Die Mitochondriale Respirationstest Solution (MiR05) wird wie bisher 2 beschrieben und enthält 0,5 mM EGTA, 3mm MgCl 2 .6 H 2 O, 20 mM Taurin, 10 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES, 1 g / L BSA, 60mm Kalium-Lactobionat, 110mm Saccharose, pH 7,1, bei 30 ° C eingestellt Filter die Lösung durch ein 0,45-um-Filter zu sterilisieren. Teilen Sie sich in 50 mL Portionen (Falcon Polypropylenröhrchen) und bei -20 ° C. Siehe die Diskussion für Rezepte. Die Löslichkeit von Sauerstoff Faktor für MiR05 bei 30 ° C und 37 ° C beträgt 0,92 3.
2. Tissue Vorbereitung
A. Cardiac Fasern mechanische Aufbereitung
- Die Verfahren wurden von der University of Calgary Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschuss und halten uns an die Canadian Association for Laboratory Animal Science-Richtlinien für Experimente.
- Genickbruch, um die Maus zu immobilisieren ist die bevorzugte Methode. Alternativ können intraperotineal (IP) Injektion von Ketamin und Xylazin (80 und 10mg/kg bzw.) oder 0,5 mg Natrium-Pentobarbital verabreicht werden. Hinweis: Natrium-Pentobarbital ist ein reversibler Inhibitor der NADH-Dehydrogenase (Komplex I) 4.
- Entfernen Sie die Herzen und legen Sie sie in einer Petrischale mit dem RP-Lösung auf Eis (Abbildung 1A). Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe und / oder Fett mit einem Dissektionsmikroskop.
- Schneiden Sie das Herz in der Mitte entlang der Nasenscheidewand. Excise 10-25mg Nassgewicht (ww) von Gewebe durch Schneiden aus dem Endokard des linken Ventrikels (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, Schnitt entlang der Faserorientierung auf mechanische Schäden an Myokard zu minimieren.
- Setzen Sie den seziert, Teilstichprobe von Gewebe in einer separaten Petrischale mit dem RP-Lösung auf Eis. Mit einem Dissektionsmikroskop schneiden Herzen in Längsstreifen entlang Faserorientierung mit einem Durchmesser von 1-1.5mm.
- Kürzen Sie die Streifen mit einem Skalpell auf eine Länge von 2-4mm (Abbildung 1C).
- Mit äußerster Sorgfalt und scharfen Pinzette mechanisch getrennten Faserbündeln. Finale Faserbündel enthalten sollte maximal 6-8 Fasern, die von kleinen Bereichen des Kontaktes an, mit einem Gewicht von nicht mehr als 5 mg ww. Cardiac Fasern von 1-3mg ww empfohlen. Optisch sollte das Herzgewebe aus original rot bis hellrosa Färbung (Abbildung 1D) zu ändern.
B. Cardiac Faserbündel chemische Herstellung
- Legen Sie eine 12-Well-Platte auf Eis.
- Spülen Sie das auch (s) mit RP-Lösung von Calcium Kontamination 5 zu minimieren.
- Übertragen Sie die mechanisch vorbereitet Faserbündel zu einem gut mit 3 ml eiskaltem RP-Lösung mit 50ug / mL Saponin. Hinweis: Die Konzentration von Saponin nicht auf die Höhe der Herzmuskel in der Lösung ab.
- Inkubieren 20min mit mildem Rühren auf Eis.
C. Cardiac Fiber Bundle Washing
- Spülen Sie einen neuen Brunnen mit MiR05 Calcium Kontamination 5 zu minimieren.
- Übertragen Sie die kardiale bündelt die neue auch mit 10 mL eiskaltem MiR05. Inkubieren 10min mit mildem Rühren auf Eis.
- Repeat (1-2) 2-3 mal mit frischem MiR05. Die wiederholte Waschschritte zur Entfernung oder Saponin, ATP, ADP und alle restlichen Substrate aus der Faserbündel zu gewährleisten.
D. Wet Gewichtsbestimmung
- Unmittelbar vor der Atemwege Analyse ist Nassgewicht, indem man die einzelnen Faserbündel (1-3mg ww) auf eine saugfähige Oberfläche (Filterpapier) mit einer Pinzette und Halten der Faser an die Oberfläche für 5s oder bis sich die Feuchtigkeit abtransportiert erhalten.
- Mit einem anderen saugfähigen Oberflächen, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der Pinzette.
- Tare Umfang und Ort der Faserbündel auf einer Kunststoff wiegen Boot für Masse-Messung.
- Übertragen Sie die kardiale Faserbündel auf einen neuen Brunnen mit eiskaltem MiR05. Das Faserbündel ist bereit für den Sauerstoffverbrauch Beurteilung.
3. Respirometrische OXPHOS Analysis
A. Respirometrische Ausstattung
- Das Labor nutzt und empfiehlt ein Zwei-Kammer-Titration-Injektion Oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). Die Oxygraph 2-k bietet eine hohe Auflösung Respirometrie zu einem großen Teil durch den Einsatz instrumental Hard-und Software (DatLab), die instrumentale Hintergrund minimiert, die dazu beitragenSauerstoffverbrauch Artefakte.
- Die Kalibrierung des Oxygraph ist ein wesentlicher Schritt, um zu verwechseln Auswirkungen der instrumentalen Sauerstoffverbrauch zu minimieren. Kalibrierung variiert leicht je nach Oxygraph. Siehe Oxygraph Bedienungsanleitung für bestimmte Verfahren.
B. Vertreter Quality Control / Technik Validation Protocol
- Stellen Sie sicher, MiR05 zu Oxygraph Kammern Gehäuse wurde hinzugefügt der polarographischen Sauerstoff-Sensoren (POS) und geben Sie ausreichend Zeit für Luft-Sättigung und des Gleichgewichts der MiR05 bei 37 ° C vor der Durchführung der murinen kardialen Fasern in die Oxygraph Kammern.
- Die Herz-Faser Proben werden in der gerührten MiR05 der Oxygraph Kammern gelegt. Hinweis: Sicherstellen, dass die Rührstäbe sind PVDF-oder PEEK-beschichtete Rührstäbchen (6mm Durchmesser).
- Mit einer Sauerstoff-Fertigspritze, erhöhen die Sauerstoffkonzentration des Oxygraph Kammern 250-550uM. Es wird darauf hingewiesen, dass die Sauerstoffkonzentration ist für permeabilisierten Faser Vorbereitungen auf sogar 50% über Luftsättigung 6 Beschränkung werden. Lassen Sie 5-10min für Sauerstoffkonzentration Stabilisierung.
- Mit einem 25 &mgr; l Hamilton Mikroliterspritze add 10 &mgr; l von 2M Glutamat und 5μL von 800mm Malat zu einer Endkonzentration von 10 mM und 2 mM zu erhalten, bzw.. Diese Titrationen erlauben die Bestimmung der basalen Komplex I-Beatmung (State 2; Abwesenheit von ADP). Oxygen flux sollte innerhalb von ca. 5min von Titration zu stabilisieren. Die richtige Vorbereitung sollte sehr gut reproduzierbar Zustand 2 Sauerstoffverbrauch.
- Nach 2-5min von stabilen Sauerstoff-Verbrauch, fügen Sie 20 &mgr; l von 500 mM ADP für eine Endkonzentration von 5 mM (Sättigung), mit einem 25 &mgr; l Hamilton Mikroliterspritze für maximal (Zustand 3) die mitochondriale Atmung durch komplexe I. Nur wenige Studien dieser hohen Einsatz von einer Konzentration von ADP, ist es jedoch wichtig zu beachten, dass mehr als 90% Sättigung nur bei Konzentrationen über 5 mM 7 erreicht.
- Nach 2-5min von stabilen Sauerstoff-Verbrauch, fügen 5μL von 4mm Cytochrom c zu einer Endkonzentration von 10 &mgr; m zu erhalten, mit einem 10 &mgr; l Hamilton Mikroliterspritze für die Qualitätskontrolle Analyse der äußeren Membran der Mitochondrien (OMM) Integrität.
- Nach 2-5min von stabilen Sauerstoff-Verbrauch, fügen 1μL von 4 mg / mL Oligomycin, mit einem 10 &mgr; l Hamilton Mikroliterspritze zur ATP-Synthase hemmen. Diese Titrationsschritt bieten Validierung der inneren Mitochondrien-Membran Unversehrtheit.
- Nach der respirometrische OXPHOS Beurteilung. Die Probe wird für Trockengewicht oder mitochondriale Marker Bestimmung erhalten.
- Entfernen MiR05 aus dem Glas Kammern des Oxygraph. Waschen Sie die Kammern mindestens dreimal mit destilliertem Wasser (ddH 2 O).
- Waschen Sie die Kammern mindestens dreimal mit 100% Ethanol (EtOH) auf EtOH-löslichen Inhibitoren wie Oligomycin entfernen.
- Waschen Sie die Kammern mit 70% EtOH dreimal mit dem endgültigen 70% EtOH waschen dauerhafte 30min auf die Oxygraph Kammern zu sterilisieren.
- Vor der Zugabe von MiR05 für neue experimentelle Titration Protokoll sicherzustellen, dass die Kammern mit den POS mindestens fünfmal mit ddH 2 O gewaschen
- Die Validierung Titrationen kann als eines bestimmten Protokolls (Abbildung 2) oder die Titrationen durchgeführt werden kann in eine gut geplante Titration Protokoll in Abhängigkeit von der experimentellen und diagnostischen Zielen der Respirometrie Studien eingeschlossen werden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Sauerstoffverbrauch in gut vorbereitet murinen kardialen Fasern wird durch die Qualitätskontrolle-Protokoll ausgewertet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Abbildungen 3-5 stellen häufigsten anzutreffende Beispiele für falsch vorbereitet kardialen Fasern. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV) ist ein wichtiger Index in Respirometrie. Dieser Parameter zeigt die Kopplung zwischen Sauerstoffverbrauch und oxidative Phosphorylierung. In permeabilisierten Faser Zubereitungen wird der RCR die Rate der Atmung im Zustand 3 in Bezug auf den Zustand 2 oder alternativ Zustand 3 über Zustand 4 (induziert durch Oligomycin und / oder Atractylosid, ATR). Darüber hinaus können RCR als Qualitätssicherung Marker verwendet werden können und Veränderungen in Kopplung aus experimentellen oder pathologischen Interventionen 5 Geben. Gut verbunden permeabilisierten murine Herzmittel ergeben einen RCR zwischen 3-6 je nach Inkubationslösung verwendet 1, 8, 9.
Die Titration von Cytochrom c wird als Validierung der richtigen Gewebe Zubereitung verwendet wird. Cytochrom c ist ein Protein in den Intermembranraum an der inneren Mitochondrienmembran 10 befindet. Wenn die äußere Membran der Mitochondrien intakt ist, bleibt das endogene Cytochrom c in den Intermembranraum und die Titration von exogenen Cytochrom c hat einen vernachlässigbaren Effekt auf die Atmung (Abbildung 2). Wenn die äußere Membran der Mitochondrien beschädigt ist, kann das endogene Cytochrom c aus dem Intermembranraum freigesetzt werden und die Atmung bis exogene Cytochrom hemmenc hinaus (Abbildung 3). Angemessene Vorbereitungen sind Erfahrungen nur eine leichte Erhöhung in Sauerstoff-Fluss nach Cytochrom c hinaus in die 5-15% Bereich 5. Darüber hinaus ermöglicht dieses experimentelle Titration für die Beurteilung der pathologischen oder experimentellen Stressor Einfluss auf die mitochondriale Außenmembran Unversehrtheit. Wenn ein Cytochrom-c-Effekt erfahren, sicherzustellen, Betreuung während der mechanischen Aufbereitung des Gewebes und / oder reduzieren Saponin-Konzentration.
Die Zugabe von Oligomycin und / oder ATR wird verwendet, um Veränderungen in Leck Atmung zu bewerten; Sauerstoffverbrauch keinen Beitrag zur ADP-Phosphorylierung 11. Zusätzlich kann diese Titration Schritt als eine Validierung der richtigen Probenvorbereitung eingesetzt werden. Control oder Wildtyp-Fasern sollten sensibel mit diesem Zusatz-und Erfahrungsaustausch eine signifikante Reduktion der Sauerstoff-Fluss. Eine niedrige RCR und geringere Empfindlichkeit gegenüber Oligomycin und / oder ATR was zu einem relativ hohen Sauerstoff-Fluss zeigt Schäden an der inneren Mitochondrienmembran während der Vorbereitung (Abbildung 4). Der Schaden wird wahrscheinlich bei der mechanischen Trennung der kardialen Fasern induziert, wie die innere mitochondriale Membran ist weniger anfällig für Beleidigung von Saponin in Bezug auf die äußere Membran der Mitochondrien. Allerdings können sowohl mechanische und chemische Aufbereitung muss entsprechend angepasst werden, um falsch vorbereitet Herzfasern 5, 12 zu vermeiden.
Die Saponin-gehäutet Faserbündel von Mäusen nicht in der RP-Lösung bleiben für mehr als 6h oder MiR05 Lösung für mehr als 2h. Fehlende Reaktion auf Substrat-Inhibitor-Entkoppler Titrationen wie in Abbildung 5 zu sehen ist bezeichnend für längere Inkubationszeiten. Nachfolgende Bemühungen sollten zu minimieren Zeiträume zwischen Tieropfer und Sauerstoffverbrauch.
Abbildung 1. Mechanische Präparation von murinen kardialen Faserbündel. A. Die gesamten Herzens unmittelbar nach Dissektion. B. Ein 10-25mg Probe des vorderen linken Ventrikels. C. Herzgewebe in 1mm Durchmesser und 2-4mm Länge Streifen getrennt. D. Abschließende kardiale Faserbündel bereit für chemische Permeabilisierung mit Saponin.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse des richtigen Gewebes Vorbereitung nutzen polarographische Bewertung. Der Zustand 2 Sauerstoff-Fluss wird durch komplexe I Substrate Glutamat und Malat (M / G) unterstützt und ist deutlich nach der Zugabe von ADP (Zustand 3) stimuliert. Keine stimulierende Wirkung von exogenen Cytochrom c hinaus zeigt die äußere Membran der Mitochondrien intakt ist. Empfindlichkeit der Sauerstoffverbrauch um Oligomycin schlägt der inneren Mitochondrienmembran Integrität intakt ist. Die Sauerstoffkonzentration in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die blaue Linie gekennzeichnet. Sauerstoffverbrauch des Herzgewebes Probe in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die rote Linie dargestellt. Malate und Glutamat, M / G; Adenosindiphosphat, ADP, Cytochrom c, Cyto c; Oligomycin, o.
Abbildung 3. Cytochrom-c-Effekt Validierung Test unter Verwendung polarographische Bewertung. Der Zustand 2 Sauerstoff-Fluss wird durch komplexe I Substrate Glutamat und Malat (M / G) unterstützt und ist deutlich nach der Zugabe von ADP (Zustand 3) stimuliert. Stimulierende Wirkung von exogenen Cytochrom c hinaus zeigt die äußere Membran der Mitochondrien Integrität gefährdet ist. Die Sauerstoffkonzentration in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die blaue Linie gekennzeichnet. Sauerstoffverbrauch des Herzgewebes Probe in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die rote Linie dargestellt. Malate und Glutamat, M / G; Adenosindiphosphat, ADP, Cytochrom c, Cyto c.
Abbildung 4. Inneren Mitochondrienmembran Integrität Validierung Test unter Verwendung polarographische Bewertung. Der Zustand 2 Sauerstoff-Fluss wird durch komplexe I Substrate Glutamat und Malat (M / G) und eine relativ schwache Stimulation der Sauerstoffverbrauch nach der Zugabe von ADP (Zustand 3) unterstützt. Schlechte Empfindlichkeit der Sauerstoffverbrauch um Oligomycin schlägt der inneren Mitochondrienmembran beschädigt ist. Die Sauerstoffkonzentration in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die blaue Linie gekennzeichnet. Sauerstoffverbrauch des Herzgewebes Probe in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die rote Linie dargestellt. Malate und Glutamat, M / G; Adenosindiphosphat, ADP Oligomycin, o.
Abbildung 5. Polarographische Beurteilung nach längerer Inkubationszeit in MiR05. Sauerstoffverbrauch ist unempfindlich gegen exogene Zugabe von Glutamat und Malat (M / G) und Sauerstoffverbrauch nach der Zugabe von ADP (Zustand 3) wird reduziert. Es gibt keine stimulierende Wirkung von exogenen Cytochrom c Addition und Unempfindlichkeit der Sauerstoffverbrauch um Oligomycin erfahren wird. Fehlende Antwort auf Ergänzungen extramitochondrialen Inkubationslösung schlägt mitochondrialen funktionelle Stabilität gefährdet ist. Die Sauerstoffkonzentration in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die blaue Linie gekennzeichnet. Sauerstoffverbrauch des Herzgewebes Probe in einem 2 mL geschlossenen Kammer wird durch die rote Linie dargestellt. Malate und Glutamat, M / G; Adenosindiphosphat, ADP, Cytochrom c, Cyto c.
1. Notes: Vorbereitung der Reagenzien
Vorbereitung der K 2 EGTA 100 mM Stammlösung
| Name des Reagenzes | Endkonzentration (mM) | g/100 mL H 2 O |
| Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA) | 100 | 3,805 |
| Kaliumhydroxid (KOH) | 200 | 1,15 |
Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4 bei Raumtemperatur.
Vorbereitung der Ca 2 EGTA 100 mM Stammlösung
| Name des Reagenzes | Endkonzentration (mM) | g/100 mL H 2 O | Kommentare (optional) |
| Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA) | 100 | 3,805 | Hitze bis 80 ° C und rühren mild. |
| Calciumcarbonat (CaCO 3) | 100 | 1,001 | Die Calcium-Konzentration muss präzise wie Calcium reguliert die Funktion der verschiedenen Organellen einschließlich Mitochondrien. Stellen Sie sicher, vollständige Solubilisierung aller CaCO 3. Die endgültige Lösung muss vollkommen transparent. CaCO 3 wird zunächst mit EGTA und etwas Wasser gemischt, um die Bildung von Kohlensäure und CO 2 Verdunstung zu aktivieren. Diese Reaktion kann durch Erhitzen bis zu 80 ° C beschleunigt werden |
| Kaliumhydroxid (KOH) | 200 | 1,15 | Neutralisieren mit KOH nach dem Verdampfen des CO 2 ist abgeschlossen. |
Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4 bei Raumtemperatur.
Vorbereitung der Entspannung und Preservation Solution (RP Lösung) 1
| Reagens | Endkonzentration (mM) | Pro Liter | Kommentare |
| K 2 EGTA | 7,23 | 72,3 mL | |
| CAK 2 EGTA | 2,77 | 27,7 mL | |
| Imidazol | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0,5 | ||
| Taurin | 20 | 2.52g | |
| Adenosin-5'-Triphosphat Dinatriumsalz-Hydrat (ATP) | 5,7 | 3.14g | |
| Phosphokreatin (PCr) | 14,3 | 4.0g | |
| Magnesiumchlorid (MgCl 2) | 6,56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14,0 g |
Hinweis: Der pH-Wert auf 7,1 bei Raumtemperatur
Vorbereitung der mitochondrialen Respirationstest Solution (MiR05 Lösung) 2
| Reagens | Endkonzentration (mM) | Pro Liter | Kommentare (optional) |
| Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA) | 0,5 | 0.190g | Wird als Chelator von Calcium |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl 2 .6 H 2 O) | 3,0 | 0.610g | Die Qualität der Faser Vorbereitung kann nicht ohne Mg 2 + getestet werden. |
| Taurin | 20,0 | 2.502g | Taurin ist eine Membran Stabilisatoren und Antioxidantien. 20 mM ist die intrazelluläre Konzentration im Herzen. |
| Kaliumphosphat einbasischen (KH 2 PO 4) | 10,0 | 1.361g | |
| 20,0 | 4.77g | ||
| Kalium-Lactobionat | 60,0 | 120 ml von 0,5 M K-Lactobionat Lager | 0,5 M K-Lactobionat Stock: Add 35,83 g Lactobionsäure auf 100 mL H 2 O und pH-Wert auf 7,0 bei RT. Anpassen der Lautstärke auf 200 ml mit ddH 2 O. Verwendet, um die hohe intrazelluläre K +-Konzentration zu replizieren. Zuvor KCl verwendet wurde, jedoch die hohen Cl-hemmt mitochondrialen Kreatinkinase-Funktion. |
| Sucrose | 110,0 | 37.65g | Wird als ROS-Fänger. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | 1g / L | 1g | Wird als eine Membran, Antioxidationsmittel und Chelator von Calcium-und freien Fettsäuren. |
Hinweis: Der pH-Wert auf 7,1 bei 30 ° C
3. Notes: Respirometrische OXPHOS Analysis
B. Wählen Substrate, Entkoppler und Inhibitoren
Liste der ausgewählten Substrate für Mitochondriale Respirationstest Analysis
| Substrate | [Stock] | Vorbereitung | Volumen pro 2 ml | [Final] | Kommentare |
| Adenosin-5'-diphosphat Monokaliumsalz Dihydrat (ADP) | 500 mM | 246mg / mL ddH 2 O. Der pH-Wert auf 7,1 bei RT. Bei -80 ° C in 250 ul Aliquots. | 20ul | 5mM | Konstant zu halten Mg 2 + + während Respirometrie Experimente add 0,6 Mol MgCl 2 / mol ADP. |
| Ascorbat | 800mm | 0.1584g / mL ddH 2 O. Lagerung bei -20 ° C in 200 ul Aliquots. Lichtempfindlich | 5 ul | 2mM | Apostelgeschichte als Substrat, wenn parallel TMPD verwendet. Muss richtige für Sauerstoff-Fluss für die Auto-Oxidation. |
| Cytochrom C | 4mm | 50 mg / mL ddH 2 O. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. | 5 ul | 10um | |
| Carbonyl Cyanid p-(Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP) | 0,1 mM | 0.254mg/10 mL 100% EtOH. Shop in Glasflaschen bei -20 ° C in 500 ul Aliquots. | Schritten von 1 ul | Wirkt als Entkoppler. Bestimmt maximal Elektronentransport Kapazität und eine Einschränkung der Elektronentransport durch Phosphorylierung System. | |
| Glutamat | 2M | 0.3742g / mL ddH 2 O. Der pH-Wert auf 7,1 bei RT. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. | 10ul | 10 mM | Apostelgeschichte als Substrat für die NADH-Dehydrogenase (Komplex I). |
| Malate | 800mm | 0.1073g / mL ddH 2 O. Der pH-Wert auf 7,1 bei RT. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. | 5UL | 2mM | Apostelgeschichte als Substrat für die NADH-Dehydrogenase (Komplex I). Kann nicht unterstützen Atmung allein. |
| Pyruvat | 1M | 11mg/0.1 mL ddH 2 O. Bereiten Sie frisch. | 5 ul | 2.5mm | Apostelgeschichte als Substrat für die NADH-Dehydrogenase (Komplex I). |
| Succinat | 1000mm | 1.3505g / 5 ml ddH 2 O. Der pH-Wert auf 7,1 bei RT. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. | 20ul | 10 mM | Apostelgeschichte als Substrat für die Succinat-Dehydrogenase (Komplex II). |
| N, N, N ', N'-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochlorid (TMPD) | 200 mM | 47.1mg / mL ddH 2 O. Add 0.8M Ascorbat Endkonzentration von 10mm bis Autooxidation Lagerung bei -20 ° C in 200 ul Aliquots zu verhindern. | 5 ul | 0,5 mM | Autoxidation der Stammlösung offensichtlich durch das Auftreten der blauen Färbung. Apostelgeschichte als Substrat, wenn parallel TMPD verwendet. Muss richtige für Sauerstoff-Fluss für die Auto-Oxidation. |
Liste der ausgewählten Inhibitoren für Mitochondriale Respirationstest Analysis
| Substrate | [Stock] | Vorbereitung | Volume 2 mL pro Kammer | [Final] | Kommentare |
| Antimycin A | 5mM | 27.4mg/10 mL 100% EtOH. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. | 1 ul | 2.5μM | Inhibitor von Coenzym Q: Cytochrom c Oxidoreduktase (Komplex III) </ Td> |
| Atractylosid | 50mM | 40mg / mL ddH 2 O. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. | 30 ul | 0,75 | Inhibitor der ATP-Synthase. |
| Oligomycin | 4mg / mL | 4mg / mL 100% EtOH. Lagerung bei -20 ° C in 200 ul Aliquots. | 1 ul | Inhibitor der ATP-Synthase. | |
| Kaliumcyanid | 1M | 65.1mg / mL ddH 2 O. Bereiten Sie frisch. Der pH-Wert auf 7,1 bei RT | 1 ul | 1mM | Inhibitor von Cytochrom c Oxidase (Komplex IV). Nutzen Sie folgenden TMPD und Ascorbat Titration zur Autoxidation zugreifen. |
| Rotenon | 0,1 mM | 0.39mg/10 mL 100% EtOH. Lagerung bei -20 ° C in 250 ul Aliquots. Lichtempfindlich. | 1 ul | 0.05μM | Inhibitor von NADH-Dehydrogenase (Komplex I). Höhere Konzentrationen können jedoch erforderlich sein, um Rotenon Zurückbehaltungsrecht Kammer zu reduzieren beginnen, wie beschrieben. |
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Discussion
Die Saponin-permeabilisierten Herz-Faser-Technik bietet eine einzigartige Kompromiss zwischen in vitro und in vivo Beurteilung der mitochondrialen OXPHOS Sauerstoffverbrauch. Vorteile dieser Technik sind physiologische Relevanz im Vergleich zu isolierten Mitochondrien als zelluläre Architektur erhöht wird beibehalten. Während der Plasmamembran abgebaut wird, intrazellulären Membranstrukturen wie Mitochondrien 12, 14, sarkoplasmatischen Retikulum 14, bleiben Myofilamente und das Zytoskelett 1, 17 intakt. Darüber hinaus sind die Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und des Zytoskeletts 1, 17 auch unverändert. Mitochondrien in permeabilisierten Fasern zeigen eine erhöhte Stabilität. Nager Faser Präparate können in eiskaltem Konservierungsstoffe Lösungen für 6h und menschliche Faserproben gespeichert werden zeigen Stabilität für bis zu 24 Stunden 18,2. Mitochondrien Erfahrung rasche Äquilibrierung mit der Inkubationslösung. Dies ermöglicht die direkte Kontrolle über ortsspezifische Analyse der Elektronen-Transportkette in Reaktion auf hinzugefügt Substraten, Inhibitoren und Entkuppler 1, 5. Darüber hinaus erfordert diese in-situ-Technik nur wenige Milligramm Gewebe.
Einschränkungen der Saponin-Haut-Faser-Technik kann nicht ignoriert werden. Cardiac Mitochondrien sind heterogen, bestehend aus zwei Subpopulationen;. Subsarcolemmal und interfibrillären In situ mitochondrialen Respirometrie beurteilt die gesamte mitochondriale Bevölkerung ohne die Fähigkeit, zwischen den Subpopulationen 5 unterscheiden. Darüber hinaus regeln verschiedene zelluläre Metaboliten und cytosolische Faktoren die Funktion der Mitochondrien. Diese cytosolischen Komponenten der kardialen Fasern werden während der Permeabilisierung Prozess, in der Unfähigkeit zu beurteilen, auf die genaue in vivo Umgebung 5 mitochondrialen verloren.
Berichterstattung Probleme sind ein wichtiges Anliegen. Sauerstoffverbrauch Messungen pro Nassgewicht oder Trockengewicht ausgedrückt werden kann, ist jedoch mitochondriale Dichte ein wichtiger Faktor in der Atemwege flux Heterogenität, wenn pro Gewebe Masse 7 ausgedrückt. Es ist wichtig, dass die Auslegung der Atemfrequenz und Veränderungen werden stark von der Wahl des Referenz-Zustand beeinflusst zu verstehen. Für einen direkten Vergleich der respirometrischen OXPHOS Ergebnisse in permeabilisierten Fasern, die Wechselkurse gegenüber einer gemeinsamen Referenz-Marker wie mitochondriale DNA, Citrat-Synthase-Aktivität, Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität und / oder Cytochrom aa3 Inhalt 19 ausgedrückt werden.
Zusammenfassend ermöglicht die permeabilisierten Faseraufbereitung in Verbindung mit Respirometrie Analyse für die Beurteilung der integrativen Funktion von Herz-Mitochondrien. Verschiedene pathologische Zustände und genetische Modelle verfügen über diese Technik genutzt. Dazu gehören die Bewertung von Medikamenten-induzierten Toxizität, Alterung, Diabetes, Herzinsuffizienz, ischämischen Schädigung und oxidativem Stress auf die mitochondriale Physiologie 5, 20. Mehrere hervorragende methodische Bewertungen und Handschriften der Saponin-permeabilisierten Faser-Technik und polarographische Sauerstoffverbrauch Beurteilung wurden bereits 1, 5, 14, 20 veröffentlicht und sind sehr zu empfehlen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Canadian Institutes of Health Research and Genome Canada unterstützt. JS hält Gehaltszuschüssen Auszeichnungen von der Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada und der kanadischen Diabetes Association. Das Labor möchte die technische Unterstützung von Oroboros Instruments bei der Akquisition der Saponin-permeabilisierten Faser-Technik anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
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