Summary
Préparation des fibres perméabilisées saponine en conjonction avec l'analyse de phosphorylation oxydative respirométriques fournit une évaluation intégrative de la fonction mitochondriale. Respiration mitochondriale dans les états physiologiques et pathologiques peuvent refléter diverses influences réglementaires, y compris les interactions des mitochondries, la morphologie et la biochimie.
Abstract
Enquête sur la fonction mitochondriale représente un paramètre important de la physiologie cardiaque que les mitochondries sont impliquées dans le métabolisme énergétique, le stress oxydatif, l'apoptose, le vieillissement, encéphalomyopathies mitochondriale et la toxicité des médicaments. Dans ce contexte, les technologies pour mesurer la fonction mitochondriale cardiaques sont en demande. Une technique qui emploie une approche intégrative pour mesurer la fonction mitochondriale est respirométriques phosphorylation oxydative (OXPHOS) analyse.
Le principe de l'évaluation OXPHOS respirométriques est centrée autour de la mesure de la concentration en oxygène en utilisant une électrode de Clark. Comme le faisceau de fibres perméabilisées consomme l'oxygène concentration en oxygène, dans les baisses de chambre fermée. En utilisant des protocoles de titration sélectionnée substrat-inhibiteur découplant, les électrons sont fournis à des sites spécifiques de la chaîne de transport d'électrons, ce qui permet l'évaluation de la fonction mitochondriale. Avant l'analyse respirométriques de la fonction mitochondriale, mécaniques et chimiques des techniques de préparation sont utilisées pour perméabiliser le sarcolemme des fibres musculaires. Perméabilisation chimique emploie saponine de façon sélective perforer la membrane cellulaire tout en conservant l'architecture cellulaire.
Ce document décrit en détail les étapes impliquées dans la préparation de saponine peau fibres cardiaques pour mesurer la consommation d'oxygène afin d'évaluer OXPHOS mitochondriale. De plus, le dépannage des conseils ainsi que des substrats spécifiques, les inhibiteurs et découpleurs qui peuvent être utilisées pour déterminer la fonction des mitochondries dans des sites spécifiques de la chaîne de transport d'électrons sont fournis. Fait important, le protocole décrit peut être facilement appliquée à des tissus cardiaques et squelettiques de divers modèles animaux et des échantillons humains.
Protocol
1. Préparation des réactifs
- La solution de relaxation et de la préservation (RP Solution) est préparé comme décrit précédemment avec des modifications mineures 1. En bref, la solution se compose de RP 2.77mM CaK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 mM imidazole, 0,5 mM de dithiothréitol, 20 mM de taurine, 50mm K-MES, 6,56 MgCl2, 5.7mm ATP, phosphocréatine 14.3mm, pH 7,1, ajusté à température ambiante (RT). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,45 um-à stériliser. Diviser en portions de 15 ml (Falcon tubes en polypropylène) et conserver à -20 ° C Voir la discussion des recettes.
- La solution respirométrie mitochondrial (MiR05) est préparé comme décrit précédemment 2 et 0,5 mM EGTA contient, 3mm MgCl2 0,6 H 2 O, de la taurine 20 mM, 10 mM KH 2 PO 4, HEPES 20 mM, 1g / L BSA, 60mm potassium lactobionate, 110mm saccharose, pH 7,1, ajusté à 30 ° C. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,45 um-à stériliser. Diviser en portions de 50 ml (Falcon tubes en polypropylène) et conserver à -20 ° C. Voir la discussion des recettes. Le facteur de solubilité de l'oxygène pour les MiR05 à 30 ° C et 37 ° C est de 0,92 3.
2. Préparation des tissus
A. Cardiac fibres préparation mécanique
- Des procédures ont été approuvées par l'Université de Calgary et de protection des animaux Utiliser Comité et respecter par l'Association canadienne pour les directives de science de laboratoire pour l'expérimentation animale.
- La dislocation cervicale pour immobiliser la souris est la méthode préférée. Alternativement, intraperotineal (IP) d'injection de kétamine et de xylazine (80 et 10mg/kg, respectivement) ou 0.5mg/kg de pentobarbital de sodium peut être administré. Remarque: Le pentobarbital sodique est un inhibiteur réversible de la NADH déshydrogénase (complexe I) 4.
- Retirez le cœur et le placer dans une boîte de Petri contenant la solution RP sur glace (figure 1A). Retirez soigneusement le tissu conjonctif et / ou de la graisse à l'aide d'un microscope de dissection.
- Couper le cœur en deux le long de la cloison. D'accise de 10 25mg poids humide (ph) des tissus en coupant de la surface de l'endocarde du ventricule gauche (figure 1B). S'assurer que l'incision est le long de l'orientation des fibres afin de minimiser les dégâts mécaniques aux myocarde.
- Placez le disséqué, sous-échantillon de tissu dans une boîte de Petri séparée contenant la solution RP sur la glace. En utilisant un microscope à dissection couper le coeur en bandes longitudinales le long d'orientation des fibres d'un diamètre de 1 à 1,5 mm.
- Raccourcir les bandes avec un scalpel pour des longueurs de 2 à 4 mm (figure 1C).
- Utiliser un soin extrême et une pince mécanique forte faisceaux de fibres distinctes. Faisceaux de fibres final devrait contenir un maximum de 6-8 fibres, reliées par de petites zones de contact, ne pesant pas plus de 5mg ww. Fibres cardiaques de 1-3mg ww sont recommandés. Visuellement, le tissu cardiaque devrait changer du rouge d'origine pour une coloration rose pâle (figure 1D).
B. cardiaque préparation chimique des faisceaux de fibres
- Placer une plaque de 12 puits sur la glace.
- Rincez le bien (s) avec une solution RP afin de minimiser la contamination de calcium 5.
- Transférer les faisceaux de fibres préparés mécaniquement à un puits contenant 3 ml solution glacée RP avec 50ug / ml saponine. Remarque: La concentration de la saponine ne dépend pas de la quantité de muscle cardiaque dans la solution.
- Incuber pendant 20min sous agitation douce sur la glace.
C. Lavage faisceau de fibres cardiaques
- Rincer avec un nouveau puits MiR05 pour minimiser la contamination de calcium 5.
- Transférer les paquets cardiaques à l'10mL nouveaux puits contenant glacée MiR05. Incuber pendant 10min sous agitation douce sur la glace.
- Répéter (1-2) 2-3 fois avec MiR05 frais. Les étapes de lavage répétitifs sont d'assurer la suppression ou la saponine, ATP, ADP et les substrats restant de faisceaux de fibres.
D. Détermination du poids humide
- Directement avant l'analyse des voies respiratoires, le poids humide est obtenu en tamponnant les faisceaux de fibres individuelles (1-3mg ww) sur une surface absorbante (papier filtre) en utilisant une pince et la tenue de la fibre à la surface pour 5s ou jusqu'à ce que toute l'humidité est méchant loin.
- En utilisant une autre surface absorbante, enlever l'excès de liquide forceps.
- Tare de l'échelle et placez le faisceau de fibres en plastique pèsent sur un bateau pour la mesure de masse.
- Transférer le faisceau de fibres cardiaques d'un nouveau puits d'glacée MiR05. Le faisceau de fibres est prêt pour l'évaluation de la consommation d'oxygène.
3. Respirométriques Analyse OXPHOS
A. Équipement respirométriques
- Le laboratoire utilise et recommande une à deux chambres de titrage injection oxygraphe (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). Le oxygraphe 2-k offre respirométrie haute résolution en grande partie par l'utilisation du matériel et des logiciels instrumentale (DatLab) qui minimise contexte instrumental qui contribuent àartefacts de la consommation d'oxygène.
- Calibrage de la oxygraphe est une étape essentielle pour minimiser les effets de confusion de la consommation d'oxygène instrumentale. Etalonnage varie légèrement selon le oxygraphe. Reportez-vous au manuel de l'utilisateur oxygraphe des procédures spécifiques.
B. Qualité Représentant validation Control Protocol / Technique
- Assurez MiR05 a été ajouté à oxygraphe chambres abritant les capteurs d'oxygène polarographique (POS) et de donner suffisamment de temps pour la saturation de l'air et l'équilibrage du MiR05 à 37 ° C avant de mettre les fibres cardiaques murines dans les chambres oxygraphe.
- Les échantillons de fibres cardiaques sont placés dans le MiR05 agitation des chambres oxygraphe. Remarque: Veiller à l'barreaux d'agitation sont PVDF ou PEEK à revêtement bars agitateur (diamètre 6mm).
- En utilisant une seringue remplie d'oxygène, augmentation de la concentration en oxygène des chambres à 250 oxygraphe-550uM. Il convient de noter que la concentration en oxygène est limitant pour les préparations de fibres perméabilisées au même 50% au-dessus de l'air de saturation 6. Laisser 5-10min pour la stabilisation de la concentration en oxygène.
- Aide d'une microseringue Hamilton 25 pi, ajouter 10 ul de glutamate 2M et 5uL de 800mm malate pour obtenir une concentration finale de 10 mm et 2 mm, respectivement. Ces titrages de permettre la détermination des complexes basale j'ai soutenu la respiration (État 2; absence d'ADP). Flux d'oxygène devrait se stabiliser au sein d'environ 5min de titrage. Une bonne préparation devrait fournir très reproductibles consommation d'oxygène Etat 2.
- Après 2-5min de la consommation d'oxygène stable, ajouter 20 pi de l'ADP 500mm pour une concentration finale de 5 mm (saturation), en utilisant une microseringue Hamilton 25 pi, pour maximale (état 3) grâce à la respiration mitochondriale complexes des études I. Peu utiliser ce haut d'une concentration d'ADP, cependant, il est important de noter que la saturation supérieure à 90% n'est atteint à des concentrations supérieures à 7 5 mm.
- Après 2-5min de la consommation d'oxygène stable, Ajouter 5uL de 4mm cytochrome c pour obtenir une concentration finale de 10 uM, en utilisant une microseringue Hamilton 10 ul, pour l'analyse de contrôle de la qualité de l'membrane mitochondriale externe (OMM) intégrité.
- Après 2-5min de la consommation d'oxygène stable, ajoutez 1 microlitre de 4mg / mL oligomycine, en utilisant une microseringue Hamilton 10 ul, pour inhiber l'ATP synthase. Cette étape de titration offrira la validation de la membrane interne des mitochondries intact.
- Suite à l'évaluation respirométriques OXPHOS. L'échantillon est conservé pour la détermination du poids sec ou de marqueur mitochondrial.
- Retirer MiR05 des chambres de verre de la oxygraphe. Lavez les chambres au moins trois fois avec de l'eau distillée (FD 2 O).
- Lavez les chambres au moins trois fois avec de l'éthanol à 100% (EtOH) pour enlever EtOH solubles inhibiteurs tels que oligomycine.
- Lavez les chambres avec 70% EtOH à trois reprises avec la finale EtOH à 70% lavez 30min durables pour stériliser les chambres oxygraphe.
- Avant l'addition du protocole de titration MiR05 pour assurer la nouvelle expérimentale chambres contenant le POS sont lavés au moins cinq fois avec ddH 2 O.
- Les titrages de validation peut être réalisée comme un protocole individuel (Figure 2) ou le titrages peuvent être inclus dans un protocole de titration bien planifiée en fonction des objectifs d'expérimentation et de diagnostic des études respirométrie.
4. Les résultats représentatifs:
La consommation d'oxygène au bien préparé murin fibres cardiaques est évalué par le protocole de contrôle de la qualité comme le montre la figure 2. Figures 3-5 fournissent des exemples fréquemment rencontrés des mal préparés fibres cardiaques. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR), représente un indice important dans respirométrie. Ce paramètre indique le couplage entre la consommation d'oxygène et la phosphorylation oxydative. Dans les préparations de fibres perméabilisées, le RCR est le taux de respiration en état 3 par rapport à l'état 2 ou bien l'état 3 sur l'état 4 (induite par oligomycine et / ou atractyloside, ATR). Par ailleurs, le RCR peut être utilisé comme un marqueur de l'assurance qualité et peuvent identifier les changements dans le couplage résultant des interventions expérimentales ou pathologiques 5. Eh bien couplé perméabilisées murin préparations cardiaques donnent un RCR entre 3-6 en fonction de la solution d'incubation utilisé 1, 8, 9.
Le titrage du cytochrome c est utilisé comme une validation de la préparation des tissus appropriés. Cytochrome c est une protéine située dans l'espace intermembranaire à la membrane mitochondriale interne 10. Lorsque la membrane externe des mitochondries est intacte, le cytochrome c endogènes reste dans l'espace intermembranaire et la titration de la cytochrome c exogènes a un effet négligeable sur la respiration (figure 2). Si la membrane externe des mitochondries est endommagé, le cytochrome c endogènes peut être libéré de l'espace intermembranaire et inhiber la respiration jusqu'à ce exogènes cytochromeOutre C (figure 3). Bonne préparation devrait connaître qu'une légère élévation de flux d'oxygène suivantes cytochrome c plus dans la gamme 5-15% 5. De plus, ce titrage expérimental permet pour l'évaluation de l'influence du stress pathologique ou expérimentale sur la membrane mitochondriale externe intact. Si un effet de cytochrome c est expérimenté, assurer des soins lors de la préparation mécanique du tissu et / ou réduire la concentration de la saponine.
L'ajout de oligomycine et / ou ATR est utilisé pour évaluer des altérations de la respiration de fuite; consommation d'oxygène ne contribuent pas à la phosphorylation de l'ADP 11. De plus, cette étape de titration peut être utilisé comme une validation de la préparation des échantillons appropriés. Fibres de commande ou de type sauvage devraient être sensibles à cet ajout et de l'expérience d'une réduction significative des flux d'oxygène. Un RCR faible et une sensibilité réduite à oligomycine et / ou ATR entraînant un flux d'oxygène relativement élevé indique des dommages à la membrane mitochondriale interne lors de la préparation (figure 4). Les dommages sont vraisemblablement induites lors de la séparation mécanique des fibres cardiaques comme la membrane mitochondriale interne est moins sensible aux insultes par un parent saponine à la membrane mitochondriale externe. Cependant, tant pour la préparation mécanique et chimique peut être ajustée en conséquence pour éviter les mal préparés fibres cardiaques, 5, 12.
Les faisceaux de fibres saponine peau de souris ne devrait pas rester dans la solution RP depuis plus de 6h ou la solution MiR05 pendant plus de 2h. L'absence de réponse au substrat-inhibiteur découplant titrages comme on le voit dans la figure 5 peut être indicatif des périodes d'incubation prolongée. Les efforts ultérieurs devraient minimiser les périodes entre les sacrifices d'animaux et de mesures de consommation d'oxygène.
Figure 1. La préparation mécanique des faisceaux de fibres cardiaques murines. A. Le cœur entier de dissection qui suit immédiatement. B. Un échantillon de 10-25mg du ventricule antérieur gauche. C. cardiaque tissus séparés en 1mm de diamètre et des bandes de longueur 2-4mm. D. final des faisceaux de fibres cardiaques prêt pour perméabilisation chimique avec de la saponine.
Figure 2. Les résultats représentatifs de la préparation des tissus bon d'utiliser les évaluations polarographique. Le flux d'oxygène état 2 est soutenue par le glutamate, je substrats complexes et malate (M / G) et est significativement stimulée après l'addition d'ADP (état 3). Aucun effet stimulateur de la cytochrome c exogènes outre indique la membrane mitochondriale externe est intacte. Sensibilité de la consommation d'oxygène pour oligomycine suggère l'intégrité membrane interne mitochondriale est intacte. La concentration d'oxygène dans une chambre de 2 ml fermé est identifié par la ligne bleue. La consommation d'oxygène de l'échantillon de tissu cardiaque dans une chambre de 2 ml fermé est représenté par la ligne rouge. Malate et du glutamate, M / G; l'adénosine diphosphate, l'ADP; cytochrome C, Cyto c; oligomycine, o.
Figure 3. Cytochrome c test de validation d'effet d'utiliser les évaluations polarographique. Le flux d'oxygène état 2 est soutenue par le glutamate, je substrats complexes et malate (M / G) et est significativement stimulée après l'addition d'ADP (état 3). Effet stimulateur de la cytochrome c exogènes outre indique l'intégrité membrane mitochondriale externe est compromise. La concentration d'oxygène dans une chambre de 2 ml fermé est identifié par la ligne bleue. La consommation d'oxygène de l'échantillon de tissu cardiaque dans une chambre de 2 ml fermé est représenté par la ligne rouge. Malate et du glutamate, M / G; l'adénosine diphosphate, l'ADP; cytochrome C, Cyto c.
Figure 4. Intérieure de test de validation de membrane mitochondriale utilisant l'évaluation de l'intégrité polarographique. Le flux d'oxygène état 2 est soutenue par le glutamate, je substrats complexes et malate (M / G) et une stimulation relativement faible de la consommation d'oxygène après l'addition d'ADP (état 3). Mauvaise sensibilité de la consommation d'oxygène pour oligomycine suggère la membrane mitochondriale interne est endommagée. La concentration d'oxygène dans une chambre de 2 ml fermé est identifié par la ligne bleue. La consommation d'oxygène de l'échantillon de tissu cardiaque dans une chambre de 2 ml fermé est représenté par la ligne rouge. Malate et du glutamate, M / G; l'adénosine diphosphate, ADP oligomycine, o.
Figure 5. Polarographique évaluation après une incubation prolongée dans MiR05. La consommation d'oxygène est insensible à l'addition exogène de glutamate et le malate (M / G) et la consommation d'oxygène après l'addition d'ADP (l'état 3) est réduit. Il n'ya pas d'effet stimulant exogène cytochrome c plus et l'insensibilité de la consommation d'oxygène pour oligomycine est expérimenté. Le manque de réponse à des ajouts à la solution d'incubation extramitochondriale suggère mitochondriale stabilité fonctionnelle est compromise. La concentration d'oxygène dans une chambre de 2 ml fermé est identifié par la ligne bleue. La consommation d'oxygène de l'échantillon de tissu cardiaque dans une chambre de 2 ml fermé est représenté par la ligne rouge. Malate et du glutamate, M / G; l'adénosine diphosphate, l'ADP; cytochrome C, Cyto c.
1. Notes: Préparation des réactifs
Préparation de K 2 Solution EGTA Stock 100 mM
| Nom du réactif | Concentration finale (mM) | g/100 ml H 2 O |
| L'éthylène glycol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) | 100 | 3,805 |
| Hydroxyde de potassium (KOH) | 200 | 1,15 |
Note: Ajuster le pH à 7,4 à la température ambiante.
Préparation de Ca 2 Solution EGTA Stock 100 mM
| Nom du réactif | Concentration finale (mM) | g/100 ml H 2 O | Commentaires (optionnel) |
| L'éthylène glycol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) | 100 | 3,805 | Chauffer à 80 ° C et remuer légèrement. |
| Carbonate de calcium (CaCO3) | 100 | 1,001 | La concentration en calcium doit être précise que le calcium régule la fonction des divers organites dont les mitochondries. Assurez solubilisation complète de tous les CaCO 3. La solution finale doit être totalement transparente. CaCO 3 est initialement mélangé à l'EGTA et de l'eau pour activer la formation d'acide carbonique et de CO 2 par évaporation. Cette réaction peut être accélérée par chauffage jusqu'à 80 ° C. |
| Hydroxyde de potassium (KOH) | 200 | 1,15 | Neutraliser avec du KOH après évaporation du CO 2 est terminé. |
Note: Ajuster le pH à 7,4 à la température ambiante.
Préparation de la solution de conservation et de relaxation (Solution RP) 1
| Réactifs | Concentration finale (mM) | Par litre | Commentaires |
| K 2 EGTA | 7,23 | 72,3 ml | |
| CaK 2 EGTA | 2,77 | 27,7 ml | |
| Imidazole | 20 | 1.36g | |
| Dithiothréitol | 0.5 | ||
| Taurine | 20 | 2.52g | |
| L'adénosine 5'-triphosphate hydrate de sel disodique (ATP) | 5.7 | 3.14g | |
| Phosphocréatine (PCr) | 14,3 | 4.0g | |
| Le chlorure de magnésium (MgCl 2) | 6,56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
Note: Ajuster le pH à 7,1 à la température ambiante
Préparation de la solution respirométrie mitochondrial (MiR05 Solution) 2
| Réactifs | Concentration finale (mM) | Par litre | Commentaires (optionnel) |
| L'éthylène glycol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) | 0.5 | 0.190g | Utilisé comme un chélateur du calcium |
| Hexahydrate de chlorure de magnésium (MgCl 2 .6 H 2 O) | 3.0 | 0.610g | La qualité de la préparation de fibres ne peut pas être testé sans Mg 2 +. |
| Taurine | 20,0 | 2.502g | La taurine est un stabilisateur de membrane et antioxydant. 20mm est la concentration intracellulaire présente dans le cœur. |
| Phosphate de potassium monobasique (KH 2 PO 4) | 10,0 | 1.361g | |
| 20,0 | 4.77g | ||
| Potassium-lactobionate | 60,0 | 120 ml de 0,5 M K-lactobionate Stock | 0,5 K-lactobionate Stock: Ajouter 35,83 g d'acide lactobionique à 100 mL H 2 O et le pH à 7,0 à la température ambiante. Réglez le volume à 200 ml avec ddH 2 O. Utilisé pour reproduire la haute concentration intracellulaire K +. Auparavant KCl a été utilisé, cependant, la haute-Cl inhibe la fonction mitochondriale de la créatine kinase. |
| Saccharose | 110,0 | 37.65g | Utilisé comme un charognard ROS. |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 1g / L | 1g | Utilisé comme une membrane stabilisatrice, antioxydant et chélateur de calcium et des acides gras libres. |
Note: Ajuster le pH à 7,1 à 30 ° C
3. Notes: Analyse respirométriques OXPHOS
B. Substrats Select, découpleurs et les inhibiteurs
Liste des substrats sélectionnés pour l'analyse de respirométrie mitochondriale
| Substrat | [Stock] | Préparation | Volume par 2 ml | [Final] | Commentaires |
| L'adénosine 5'-diphosphate dihydraté sel monopotassique (ADP) | 500mm | 246mg / ml ddH 2 O. Ajuster le pH à 7,1 à la température ambiante. Conserver à -80 ° C dans 250 aliquotes. | 20ul | 5mM | Pour maintenir constante Mg 2 + + lors d'expériences de respirométrie ajouter 0,6 mole de MgCl 2 / mol d'ADP. |
| L'ascorbate | 800mm | 0.1584g / mL ddH 2 O. Conserver à -20 ° C en aliquots de 200 ul. Sensible à la lumière | 5 ul | 2mM | Agit comme substrat lorsqu'il est utilisé en parallèle avec TMPD. Doit corriger pour le flux d'oxygène pour l'auto-oxydation. |
| Cytochrome C | 4 mM | 50mg / ml ddH 2 O. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. | 5 ul | 10um | |
| Carbonyle du cyanure p-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) | 0,1 mM | 0.254mg/10 ml de EtOH à 100%. Conserver dans des flacons en verre à -20 ° C en aliquotes de 500 uL. | Étapes de 1 pl | Agit comme un découplant. Détermine la capacité de transport maximale d'électrons et de toute limitation de transport des électrons par le système de phosphorylation. | |
| Le glutamate | 2M | 0.3742g / mL ddH 2 O. Ajuster le pH à 7,1 à la température ambiante. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. | 10ul | 10mM | Agit comme un substrat pour NADH déshydrogénase (complexe I). |
| Malate | 800mm | 0.1073g / mL ddH 2 O. Ajuster le pH à 7,1 à la température ambiante. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. | 5ul | 2mM | Agit comme un substrat pour NADH déshydrogénase (complexe I). Ne peut pas soutenir la respiration seul. |
| Pyruvate | 1M | 11mg/0.1 ml ddH 2 O. Préparer une solution fraîche. | 5 ul | 2,5 mM | Agit comme un substrat pour NADH déshydrogénase (complexe I). |
| Succinate | 1000mm | 1.3505g / 5 ml ddH 2 O. Ajuster le pH à 7,1 à la température ambiante. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. | 20ul | 10mM | Agit comme un substrat pour la succinate déshydrogénase (complexe II). |
| N, N, N ', N'-tétraméthyl- pphenylenediamine Dichlorhydrate (TMPD) | 200 mM | 47.1mg / mL ddH 2 O. Ajouter ascorbate 0,8 M à une concentration finale de 10 mM pour empêcher l'auto-oxydation Conserver à -20 ° C en aliquots de 200 ul. | 5 ul | 0,5 mM | L'auto-oxydation de la solution mère évidente par l'apparition d'une coloration bleue. Agit comme substrat lorsqu'il est utilisé en parallèle avec TMPD. Doit corriger pour le flux d'oxygène pour l'auto-oxydation. |
Liste des inhibiteurs sélectionnés pour l'analyse de respirométrie mitochondriale
| Substrat | [Stock] | Préparation | Volume par 2 ml de chambre | [Final] | Commentaires |
| Antimycine A | 5mM | 27.4mg/10 ml de EtOH à 100%. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. | 1 ul | 2.5μM | Inhibiteur de la coenzyme Q: cytochrome c oxydoréductase (complexe III) </ Td> |
| Atractyloside | 50mM | 40mg / ml ddH 2 O. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. | 30 uL | 0,75 | Inhibiteur de l'ATP synthase. |
| Oligomycine | 4mg / mL | 4mg / ml EtOH à 100%. Conserver à -20 ° C en aliquots de 200 ul. | 1 ul | Inhibiteur de l'ATP synthase. | |
| Le cyanure de potassium | 1M | 65.1mg / mL ddH 2 O. Préparer une solution fraîche. Ajuster le pH à 7,1 à la température ambiante | 1 ul | 1mM | Inhibiteur du cytochrome c oxydase (complexe IV). Utiliser TMPD suivantes et titrage ascorbate d'accéder à l'auto-oxydation. |
| La roténone | 0,1 mM | 0.39mg/10 ml de EtOH à 100%. Conserver à -20 ° C dans 250 aliquotes. Sensible à la lumière. | 1 ul | 0.05μM | Inhibiteur de NADH déshydrogénase (complexe I). Des concentrations plus élevées peuvent être nécessaires, cependant, de réduire la rétention de la roténone dans la chambre commence comme indiqué. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La technique de la saponine perméabilisées fibres cardiaques offre un compromis unique entre in vitro et in vivo l'évaluation de la consommation d'oxygène des mitochondries OXPHOS. Avantages de cette technique comprennent une augmentation pertinence physiologique par rapport aux mitochondries isolées de l'architecture cellulaire est préservée. Alors que la membrane plasmique est dégradé, les structures membranaires intracellulaires, y compris 12 des mitochondries, 14, 14 du réticulum sarcoplasmique, myofilaments et le cytosquelette 1, 17 demeurent intactes. Par ailleurs, les interactions entre les mitochondries et du cytosquelette 1, 17 sont également inchangées. Les mitochondries dans les fibres perméabilisées montrent une stabilité accrue. Préparations de fibres rongeurs peuvent être stockées dans les solutions de conservations glacée pour les échantillons de fibre de 6h et humaines montrent une grande stabilité pour un maximum de 18,2 24h. Équilibration expérience Mitochondries rapide avec la solution d'incubation. Cela permet un contrôle direct sur une analyse spécifique de la chaîne de transport des électrons en réponse à des substrats ajoutée, les inhibiteurs et découpleurs 1, 5. De plus, cette technique in situ nécessite seulement quelques milligrammes de tissu.
Limites de la technique de la fibre saponine peau ne peut être ignorée. Mitochondries cardiaques sont hétérogènes, composé de deux sous-populations;. Sarcolemme et interfibrillaires En respirométrie mitochondriale in situ évalue la population totale des mitochondries sans la capacité de distinguer entre les cinq sous-populations. En outre, les différents métabolites cellulaires et des facteurs cytosoliques réguler la fonction mitochondriale. Ces composants cytosoliques des fibres cardiaques sont perdues pendant le processus de perméabilisation résultant de l'impossibilité d'évaluer mitochondriale à l'exacte environnement in vivo 5.
Questions d'information sont une préoccupation importante. Mesures de consommation d'oxygène peuvent être exprimés par rapport au poids humide ou poids sec, cependant, la densité mitochondriale est un facteur majeur dans l'hétérogénéité du flux respiratoire lorsqu'il est exprimé par sept masse de tissu. Il est important de comprendre que l'interprétation des taux respiratoires et les changements sont grandement influencés par le choix d'un état de référence. Pour les comparaisons directes des résultats OXPHOS respirométriques en fibres perméabilisées, les taux doivent être exprimés par rapport à un repère de référence communs tels que l'ADN mitochondrial, l'activité de la citrate synthase, l'activité cytochrome c oxydase, et / ou le contenu cytochrome aa3 19.
En résumé, la préparation des fibres perméabilisées utilisé en conjonction avec l'analyse respirométrie permet l'évaluation de la fonction intégrative des mitochondries cardiaques. Divers états pathologiques et les modèles génétiques ont utilisé cette technique. Il s'agit notamment de l'évaluation de la toxicité médicamenteuse, le vieillissement, le diabète, insuffisance cardiaque congestive, une lésion ischémique et le stress oxydatif sur la physiologie mitochondriale 5, 20. Plusieurs excellentes critiques méthodologiques et des manuscrits de la technique de la fibre saponine perméabilisées et polarographique appréciation consommation d'oxygène ont été précédemment publiés 1, 5, 14, 20 et sont fortement recommandés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par les Instituts canadiens de recherche en santé et Génome Canada. JS détient bourses d'aide salariale de l'Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation du Canada et l'Association canadienne du diabète. Le laboratoire tient à souligner l'aide technique des instruments Oroboros lors de l'acquisition de la technique des fibres perméabilisées saponine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
